universidade federal de goiás pró-reitoria de ... - PRPG - CIAMB

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS

WANESSA FERNANDES CARVALHO

AVALIAÇÃO GENOTÓXICA E MUTAGÊNICA DE HERBICIDAS EM ORGANISMOS AQUÁTICOS

GOIÂNIA - GO 2018

WANESSA FERNANDES CARVALHO

AVALIAÇÃO GENOTÓXICA E MUTAGÊNICA DE HERBICIDAS EM ORGANISMOS AQUÁTICOS

Orientadora: Profª. Drª. Daniela de Melo e Silva Coorientador: Prof. Dr. Marcelo Luis Larramendy

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade Federal de Goiás como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Ambientais.

Março 2018

AGRADECIMENTOS

Agradeço com muito carinho aos meus pais Germano Fernandes dos Santos e Marilene Carvalho Fernandes e minha irmã Talita Fernandes Carvalho pela paciência e pelo incentivo há todos esses anos dedicados à pesquisa. Ao meu namorado Raphael Pires de Campos pela força, confiança e compreensão. Obrigada por acreditar que venceremos juntos os desafios da vida. À minha orientadora Profª Drª Daniela de Melo e Silva pela sua amizade, dedicação, disponibilidade e principalmente pela confiança no meu trabalho. O seu incentivo e orientação foram fundamentais durante a execução deste estudo. Aos meus amigos e pesquisadores do Laboratório de Mutagênese da Universidade Federal de Goiás (LabMut): Drª Fernanda Craveiro Franco, Drª Fernanda Ribeiro Godoy, Drª Juliana Boaventura Avelar, Drº Rodrigo Roncato Roncato Pereira, Drº Hugo Freire Nunes, Ms. Jhennefer Sonara Aguiar Ramos, Ms. Alessandro Arruda Alves, Daiany Folador Sotero, Thaís Milena Alves Pedroso e Camila Provásio Figueredo, que contribuíram no desenvolvimento e finalização deste estudo. À Universidade Federal de Goiás, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais responsável pela formação de mestres e doutores. À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE) pelo suporte financeiro. Aos professores Drº Fausto Nomura e Drª Simone Saboia pela oportunidade de desenvolver projetos em parcerias. A Universidad Nacional de La Plata – Argentina em nome de Drº Marcelo Lius Larramendy, Drª Sonia Soloneski, Celeste Ruiz de Arcaute e Milagros Laborde pelo comprometimento e parceria e na realização desta pesquisa. Vocês sem dúvida se tornaram grandes amigos e fazem parte do meu crescimento pessoal e profissional. Ao Núcleo de Pesquisas Replicon da Pontifícia Universidade Católica de Goiás em especial ao professor Drº Aparecido Divino da Cruz e ao professor Drº Cláudio Carlos da Silva pela parceria e sugestões ao longo do estudo. Eu agradeço a equipe LabMut e a todos aqueles que colaboraram com o planejamento e desenvolvimento dos experimentos.

SUMÁRIO CAPÍTULO I 1. ECOTOXICOLOGIA E MEIO AMBIENTE ..................................................................... 15 2. PESTICIDAS ...................................................................................................................... 18 2.1. Classificação dos pesticidas ....................................................................................... 19 2.2. Características e modo de ação dos herbicidas....................................,,,....................22 2.2.1. Roundup® e Glifosato .............................................................................................. 22 2.2.2. Ácido 2,4-diclorofenoxiacético ............................................................................... 25 2.2.3. Interação entre os herbicidas ................................................................................... 29 3. GENOTOXICIDADE E MUTAGENICIDADE DOS HERBICIDAS ............................... 30 3.1. Ensaio Cometa ............................................................................................................ 32 3.2. Teste do Micronúcleo ................................................................................................. 36 4. BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL.....................................................38 4.1. Anfíbios.......................................................................................................................38 4.2. Declínio de anfíbios .................................................................................................... 43 4.3. Peixes..........................................................................................................................45 5. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 49 5.1. Geral ........................................................................................................................... 49 5.2. Específicos.................................................................................................................. 49 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 50

CAPÍTULO II Evaluation of genotoxic and mutagenic effects of glyphosate Roundup Original® in Dendropsophus minutus Peters, 1872 tadpoles ABSTRACT ............................................................................................................................. 63 1. INTRODUCTION ............................................................................................................... 64 2. MATERIAL AND METHODS............................................................................................ 66 2.1. Chemical compost.......................................................................................................66 2.2. Test organism sampling..............................................................................................66 2.3. Acute toxicity biossay……………………..………………………………………...66 2.4. Comet assay or alkaline single-cell gel electrophoresis……………………….…….67 2.5. Micronucleus test (MN)……………………………………..………………………68 2.6. Statistical analysis…………………………………………………...………………68 3. RESULT ............................................................................................................................... 69

3.1. Acute toxicity bioassay……………………………………………...………………69 3.2. Comet assay or alkaline single-cell gel electrophoresis……………..………………69 3.3. Micronucleus test……………………...……………………………….……………71 4. DISCUSSION ......................................................................................................................72 5. REFERENCES……………………………………………………………….……………76

CAPÍTULO III Dna damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides on Rhinella arenarum (anura, bufonidae) tadpoles ABSTRACT ............................................................................................................................. 84 1. INTRODUCTION ................................................................................................................ 85 2. MATERIAL AND METHODS............................................................................................ 87 2.1. Chemicals ................................................................................................................... 87 2.2. Quality control ............................................................................................................ 87 2.3. Anuran tadpoles .......................................................................................................... 87 2.4. Determination of LC50 values ................................................................................... 88 2.5. Single-cell gel electrophoresis assay .......................................................................... 88 2.6. Statistical analysis ...................................................................................................... 89 3. RESULTS ............................................................................................................................. 89 3.1. Chemical analysis…………………………………………………………………...89 3.2. Lethal end-points……………………………………………………………………89 3.3. Sublethal end points: DNA damage………………………………………………...90 3.3.1. Glyphosate-based herbicide-exposed larvae……………………………………...90 3.3.2. Imazethapyr-based herbicide-exposed larvae…………………………………….90 3.3.3. Glyphosate- plus imazethapyr-based herbicide-treated larvae………………...….90 4. DISCUSSION......................................................................................................................93 5. ACKNOWLEDGEMENTS.................................................................................................96 6. REFERENCES………………………………………………………………………….....97

CAPÍTULO IV Acute lethality and genotoxicity assessment of four herbicides, alone and in binary mixtures, towards Cnesterodon decemmaculatus (pisces, poeciliidae) ABSTRACT .......................................................................................................................... 105 1. INTRODUCTION ............................................................................................................. 106 2. MATERIAL AND METHODS.......................................................................................... 108 2.1. Chemicals ................................................................................................................. 108 2.2. Quality control .......................................................................................................... 108 2.3. Test organisms .......................................................................................................... 109 2.4. Determination of LC50.............................................................................................109 2.5. Single Cell Gel Electrophoresis Assay (SCGE).......................................................109 2.6. Statistical analysis .................................................................................................... 110 3. RESULTS...........................................................................................................................111 3.1. Chemical analysis.....................................................................................................111 3.2. Mortality...................................................................................................................111 3.3. DNA damage............................................................................................................111 4. DISCUSSION……………………………………...…………………………………….115 5. CONCLUSION..................................................................................................................117 6. ACKNOWLEDGEMENTS...............................................................................................117 7. REFERENCES…………………………………………………………………….…….117 ANEXO I – Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO.................. 125 ANEXO II – Comite de Ética de Uso de Animais (CEUA) ................................................... 129

LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I ECOTOXICOLOGIA E MEIO AMBIENTE Tabela 1. Classificação dos pesticidas quanto à sua toxicidade...............................................20 Tabela 2. Classificação dos pesticidas quanto ao seu mecanismo de ação e agrupamento químico......................................................................................................................................20 CAPÍTULO II Evaluation of genotoxic and mutagenic effects of glyphosate Roundup Original® in Dendropsophus minutus Peters, 1872 tadpoles Table 1. Mean and standard deviation of the physicochemical parameters of the concentrations of glyphosate-Roundup Original®……………………………………...........69 CAPÍTULO III Dna damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides on Rhinella arenarum (anura, bufonidae) tadpoles Table 1. Analysis of DNA damage estimated by the single-cell gel electrophoresis assay in peripheral blood cells of Rhinella arenarum tadpoles exposed to GLY-based Credit® and IMZT-based Pivot® H commercial formulations.....................................................................92

CAPÍTULO IV Acute lethality and genotoxicity assessment of four herbicides, alone and in binary mixtures, towards Cnesterodon decemmaculatus (pisces, poeciliidae) Table 1. Analysis of DNA damage measured by comet assay in peripheral blood erythrocytes of Cnesterodon decemmaculatus cells exposed to GLY and 2,4-D (ester, acid amine and mixtures).................................................................................................................................114

LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I ECOTOXICOLOGIA E MEIO AMBIENTE Figura 1. Estrutura molecular do herbicida Glifosato...............................................................22 Figura 2. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D ácido...........................................................26 Figura 3. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D éster............................................................27 Figura 4. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D amina..........................................................28 Figura 5. Imagens de nucleóides formando cometas com diferentes graus de dano ao DNA e representação esquemática mostrando a divisão entre a cauda e a cabeça de um cometa.......................................................................................................................................33 Figura

6.

Macho

de

D.

minutus

vocalizando

(a).

Desova

de

D.

minutus

(b)..............................................................................................................................................41 Figura 7. Rhinella arenarum (a). Girino de R. arenarum estágio Gosner 37 (b)....................42 Figura

8.

Macho

de

Cnesterodon

decemmaculatus

(Jenyns,

1842).........................................................................................................................................48

CAPÍTULO II Evaluation of genotoxic and mutagenic effects of glyphosate Roundup Original® in Dendropsophus minutus Peters, 1872 tadpoles Figure 1. Images of comet assay detected in tadpoles of Dendropsohus minutus tadpoles demonstrating in A. No DNA damage; B. Minor DNA damage; C. Increasing DNA damage. D. Major DNA damage.............................................................................................................70 Figure 2. DNA Damage assessment in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872). A. Tail length, B. Percentage of DNA in the tail; C Olive moment, at concentrations of glyphosate-Roundup Original® (T1 = 0.28 mg ai / L, T2 = 1 mg ai / L, T3 = 2 mg ai / L, T4 = 4 mg ai / L and control negative - CN).....................................................................................70 Figure 3. Analysis of covariance indicating and increase of binucleate cells according to temperature

despite

the

concentration

of

glyphosate-Roundup

Original®……………………………………………………………………………………..71 Figure 4. Micronucleus (A) and Binucleated cells (B) detected in tadpoles of Dendropsohus minutus......................................................................................................................................71

CAPÍTULO III Dna damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides on Rhinella arenarum (anura, bufonidae) tadpoles Figure 1. DNA damage induced by Credit® (light grey bars) and Pivot® H (dark grey bars), detected by the single cell gel electrophoresis assay in Rhinella arenarum tadpoles exposed under laboratory conditions. Tadpoles were exposed for 96 h to either Credit® or Pivot® H at 5% and 10% of each LC5096 h concentration and to binary mixtures (black bars) of Credit ®Pivot® H at 5% of each LC5096

h

concentration and 10% of each LC50

96 h

concentration.

Results are expressed as pooled values of genetic damage indexes from three independent experiments. Negative (NC; untreated larvae) controls and positive controls (PC; 40 mg/L cyclophosphamide-treated larvae) (white bars) were run simultaneously with herbicideexposed tadpoles. *, P < 0.05; ***, P < 0.001 (significant differences compared to negative control values).

##

, P < 0.01;

###

, P < 0.001 (significant differences compared to herbicide-

alone values)………………………………………………………………………………….91

CAPÍTULO IV Acute lethality and genotoxicity assessment of four herbicides, alone and in binary mixtures, towards Cnesterodon decemmaculatus (pisces, poeciliidae) Figure 1. Analysis of genomic damage index (GDI) measured by comet assay in peripheral blood erythrocytes of Cnesterodon decemmaculatus cells exposed to GLY and 2,4-D (ester, acid amine and mixtures). NC = Negative control; PC = Positive control; * = different with Gly and mixture; # = distinct formulations of 2,4D and mixture; * = P<0.05; ** = P<0.01; *** = P<0.001.………………………………………………………..………………………….115

RESUMO

O aumento da utilização dos pesticidas, os riscos e perturbações que esses compostos podem provocar aos organismos e ao meio ambiente está sendo bastante discutido nos últimos anos. Os herbicidas 2,4-D e glifosato são aplicados em pós-emergência em culturas de larga escala e desempenham um papel importante na otimização da produção agrícola em todo o mundo. Os bioindicadores de qualidade ambiental são utilizados em estudos de avaliações de impacto ambiental devido sua interação com o meio ambiente e a sua facilidade de absorção e acumulação de compostos xenobióticos (Younes, 2000). Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos genotóxicos e mutagênicos de herbicidas em biondicadores de qualidade ambiental. A toxicidade aguda do Credit® a 48%, Herbifen Super® a 97%, Weedar Full® a 83.5%, Dedalo elite® a 30% e Imazethapyr e suas combinações binárias foram testadas em Cnesterodon decemmaculatus, Rhinella arenarum e Dendropsophus minutus. O efeito letal foi determinado a partir de experiências com mortalidade e o subletal foi utilizado o bioensaio de eletroforese em gel de célula única (SCGE) e oteste do micronúcleo. O valor LC5096h para Herbifen Super® foi de 2.668 mg / L, Weedar Full® foi de 678,04 mg/L, Dedalo elite® foi de 0,463 mg/L e para Credit® foi de 91.73 mg /L e Imazethapyr® foi de 0.99 mg/L. Os resultados deste estudo demontraram que o ensaio cometa e o teste do micronúcleo são métodos altamente sensíveis para a detecção de danos ao DNA induzidos por herbicidas em organismos aquáticos. Os herbicidas testados revelaram diferentes comportamentos ao serem combinados em suas concentrações de 5% e 10% da CL5096h. O efeito tóxico da combinação entre Herbifen Super® e Credit® deu-se basicamente pela ação do princípio ativo glifosato presente no Credit®. Para os herbicidas Weedar Full® e Dedalo elite® foi observado um sinergismo nas combinações de 5% e 10% dos valores de CL5096h. Nosso estudo constitui o primeiro relatório sobre a indução de efeitos agudos letais e subletal de combinações binárias de Credit®; Herbifen Super®, Weedar Full®, Dedalo elite®; Imazethapyr® em organismos aquáticos. Palavras-chave Mistura binária de herbicidas; Credit®; Herbifen Super®; Weedar Full®; Dedalo elite®; Imazethapyr®; Ensaio do cometa; Teste do micronúcleo; Peixes; Anfíbios.

13

ABSTRACT

The increased use of pesticides, the risks and disruptions that these compounds can cause to organisms and the environment has been much discussed in recent years. 2,4-D and glyphosate herbicides are applied post-emergence in large-scale crops and play an important role in the optimization of agricultural production worldwide. Environmental quality bioindicators are used in environmental impact assessment studies because of their interaction with the environment and their ease of absorption and accumulation of xenobiotic compounds (Younes, 2000). Therefore, the objective of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effects of herbicides on environmental quality bionicators. Acute toxicity of Credit® at 48%, Herbifen Super® at 97%, Weedar Full® at 83.5%, Dedalo elite® at 30%, and Imazethapyr and their binary combinations were tested on Cnesterodon decemmaculatus, Rhinella arenarum and Dendropsophus minutus. The lethal effect was determined from experiments with mortality and the sublethal was used the single cell gel electrophoresis (SCGE) bioassay and the micronucleus test. The LC5096h value for Herbifen Super® was 2.668 mg / L, Weedar Full® was 678.04 mg / L, Dedalo elite® was 0.463 mg / L and for Credit® was 91.73 mg / L and Imazethapyr® was 0.99 mg / L. The results of this study demonstrated that the comet assay and the micronucleus test are highly sensitive methods for the detection of herbicide-induced DNA damage in aquatic organisms. The herbicides tested showed different behaviors when combined at their concentrations of 5% and 10% of LC5096h. The toxic effect of the combination of Herbifen Super® and Credit ® was basically due to the action of the active principle glyphosate present in Credit®. For Weedar Full® and Dedalo elite® herbicides, synergism was observed in combinations of 5% and 10% of LC5096h values. Our study is the first report on the induction of lethal acute and sublethal effects of Credit® binary combinations; Herbifen Super®, Weedar Full®, Dedalo elite®; Imazethapyr® in aquatic organisms. Keywords: Binary herbicide mixture; Credit®; Herbifen Super®; Weedar Full®; Dedalo elite®; Imazethapyr®; Comet test; Micronucleus test; Fish; Amphibians.

14

CAPÍTULO I

1. ECOTOXICOLOGIA E MEIO AMBIENTE O ambiente é um sistema de relações entre ser humano-natureza, entre os sujeitos (indivíduos, grupos e sociedade) e também entre a fauna, flora, solo e ar. Dessa forma o meio ambiente pode ser conceituado como um lugar onde os elementos naturais e sociais estão em relações dinâmicas e em constante interação (Figueiredo e Neto, 2009). A Revolução Verde transformou a paisagem do meio agrícola e trouxe inovações tecnológicas resultando no uso intensivo de compostos químicos (Cunha et al. 2003). Em 1960 Truhaut iniciou-se a preocupação sobre o aumento da utilização dos pesticidas e o conhecimento dos riscos e perturbações que esses compostos poderiam provocar nos organismos e ao meio ambiente. A aplicação desordenada dos pesticidas, desde o início da agricultura, fez com que a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (UNITED

STATES

ENVIRONMENTAL

PROTECTION

AGENCY)

iniciasse

o

desenvolvimento de testes em curto prazo para estimar a toxicidade aguda dos compostos químicos (Usepa, 1980). O aumento do uso destes compostos tem trazido uma série de transtornos e modificações no ambiente, tanto pela contaminação das comunidades dos seres vivos como pela acumulação nos segmentos bióticos e abióticos do ecossistema (biota, água, ar, solo, etc.) (Ferreira et al. 2006). Os resíduos industriais, domésticos e da agricultura são as maiores ameaças ambientais aos ecossistemas de água doce e têm trazido inúmeros prejuízos genéticos e toxicológicos a vida aquática. O uso de contaminantes tem aumentado devido à conversão de pequenas propriedades em grandes monoculturas, contribuindo substancialmente para o aumento do consumo contínuo de pesticidas (De Silva & Samayawardhena, 2002). A ciência toxicológica é uma ferramenta importante para analisar os efeitos nocivos dos pesticidas em espécies não alvos (Silva et al. 2013). O efeito tóxico dos compostos sobre os sistemas, órgãos, tecidos e células fornece uma relação entre o grau de exposição e a gravidade dos efeitos adversos dos compostos químicos sobre os organismos expostos (Usepa, 2016). Os pesticidas quando lançados no ambiente, são capazes de interagir com o organismo vivo, causando múltiplas alterações que podem gerar graves desequilíbrios ecológicos, dependendo do grau de contaminação e do tempo de exposição (Veiga, 2006).

15

Os agentes tóxicos são capazes de desestruturar o equilíbrio orgânico e podem provocar alterações na homeostase do organismo (Larini, 1993; Souza, 2008). O uso indiscriminado dos pesticidas podem contaminar o solo e os recursos hídricos, promovendo alterações significativas nos ecossistemas e na degradação do meio ambiente (Relyea, 2005; Jones, 2011). Neste contexto, os testes de toxicidade são utilizados na identificação e na avaliação da dose-resposta de um composto caracterizando a relação entre a dose do contaminante e a frequência dos efeitos adversos que podem ser provocados à saúde da população exposta (Silva et al. 2013). Os impactos e efeitos adversos provocados pelos pesticidas sobre a biota também podem ser mensurados por estudos ecotoxicológicos que permitem avaliar a sensibilidade de organismos a diversas fontes poluidoras (Lombardi, 2004). Os bioensaios ecotoxicológicos são capazes de avaliar a ação e os efeitos tóxicos dos xenobióticos bioacumulados no sistema imune dos organismos aquáticos (Ferreira, 2004). Estes também permitem investigar os efeitos ambientais de poluentes em organismos vivos informando a relação entre os compostos químicos e a qualidade biológica, incluindo a identificação de causa e efeito (Besten; Munawar, 2005). Os bioensaios realizados com organismos aquáticos avaliam a mortalidade como variável resposta baseado em experimentos de exposição aguda, no entanto, outros fatores podem ser avaliados em longo prazo e são determinantes para o real conhecimento da ação de pesticidas sobre os organismos não alvos. Segundo Relyea (2012) muitos estudos laboratoriais que abordam a letalidade dos compostos químicos sobre os organismos se baseiam em experimentos em um curto período de tempo - 1 a 4 dias (testes de toxicidade aguda). Dessa forma, não é evidenciado o impacto dos pesticidas e da interação dos mesmos com outros fatores ambientais (pH, temperatura) que podem aumentar a letalidade desses compostos, principalmente em indivíduos que passam por um longo período de exposição (exposição

crônica)

e

nas

espécies

que

apresentam

caracteres

morfológicos

e

comportamentais específicos (ClementS e Rohr 2009, Relyea e Hoverman 2006, Relyea 2005, 2005a, 2012). Os testes de toxicidade e o modo de ação dos pesticidas são realizados para avaliar os riscos ambientais dos compostos químicos sobre os vertebrados (Walker et al. 2006). Estes testes são realizados em organismos modelo expostos a um composto possivelmente tóxico por até 96 horas e geralmente são utilizados para comparar a sensibilidade de cada espécie a diferentes compostos químicos (Astm, 2002). Embora a poluição ambiental seja um problema 16

internacional, os testes toxicológicos nem sempre são utilizados para atender às exigências de autoridades reguladoras nacionais (BRAGUINI et al. 2005). A maioria dos testes de toxicidade fornece uma estimativa de concentração letal média necessária para provocar a mortalidade de 50% dos indivíduos expostos a determinadas quantidades de compostos químicos (CL50). A concentração letal (CL50) está relacionada com o período de exposição, ou seja, quanto maior a exposição, menor será a LC50, sendo assim, quando o limite de CL50 é atingido, o sistema entra num estado de equilíbrio, cuja concentração do composto químico no tecido não aumenta com o passar do tempo. Todos os testes de toxicidade são realizados em condições laboratoriais bem controladas, diferindo das condições que prevalecem no meio natural (Walker et. al. 2006). No Brasil os resíduos de pesticidas, mesmo em baixas concentrações, podem provocar a contaminação dos ambientes aquáticos. De maneira geral a contaminação de água subterrânea brasileira é considerada moderada quando comparada aos países do hemisfério norte como Grã-Bretanha, Alemanha, Estados Unidos, Grécia, Bulgária, Espanha e Portugal (Ribeiro et al. 2007). Os testes de toxicidade aguda e crônica são altamente necessários para avaliação de efeitos letais e subletais nas espécies nativas do Brasil, especialmente no bioma Cerrado, considerado um hotspot de biodiversidade (Myers et al. 2000) e que apresenta a maior expectativa de degradação e avanço agrícola (Schiesari e Grillitsch, 2011). Os impactos ambientais e sociais são agravados pela ampla utilização indevida de pesticidas, pelo desconhecimento dos riscos associados a sua utilização, pelo desrespeito às normas de segurança, pela livre comercialização, pela pressão comercial por parte das empresas produtoras e distribuidoras e os problemas sociais presentes, principalmente, no meio rural (Hoshi, 2009; Ribeiro et al. 2009). Os possíveis efeitos tóxicos da exposição a pesticidas são conhecidos, porém, as informações da toxicidade relacionada aos ingredientes ativos, não são suficientes para avaliar o risco dos efeitos adversos dos pesticidas sobre a saúde humana e ambiental, com isso se fazem necessários estudos para conhecimento da toxicidade e comportamento no ambiente de forma mais detalhada em diferentes condições ambientais visando diminuir os riscos à biota e a possível contaminação de água, ar, solo e alimentos. (Ribeiro et al. 2009).

17

2.

PESTICIDAS Os pesticidas são compostos manufaturados utilizados na agricultura para prevenir ou

reduzir efeitos adversos de pragas (Hoshi, 2009). A Lei nº 7.802 caracteriza os pesticidas como produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas, e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos. Os princípios ativos, produtos técnicos, matérias-primas e ingredientes inertes são considerados componentes dos pesticidas e suas substâncias e produtos são empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores do crescimento (Brasil, 1989). A Revolução Verde iniciada na segunda metade do século XX como modelo de produção racional, voltado à expansão das agroindústrias, com base na intensiva utilização de sementes híbridas, de insumos industriais (fertilizantes e pesticidas), mecanização da produção, uso extensivo de tecnologia no plantio, na irrigação e na colheita (Moreira; Queiroz, 2007). O Brasil, na década de 70, criou o Sistema Nacional de Crédito Rural (SNCR) cuja parte do recurso era obrigatoriamente destinada à compra de pesticidas no país objetivando aumentar estrondosamente a produtividade agrícola. O Programa Nacional de Defensivos Agrícolas, no âmbito do II Plano Nacional de Desenvolvimento estimulou a produção e consumo de pesticidas através da disponibilização de recursos para a criação de empresas nacional e incentiva para a produção de insumos agrícolas no Brasil (Londres, 2011). No início do século XX iniciaram-se estudos que empregavam o uso de substâncias inorgânicas para a proteção de plantas. Substâncias à base de cobre, chumbo, mercúrio e cádmio foram desenvolvidos comercialmente e empregados contra uma grande variedade de pragas. Novas tecnologias foram disponibilizadas para o controle de doenças, aumento da produtividade e proteção contra insetos e outras pragas sendo muitas vezes baseadas no uso extensivo de agentes químicos (Ribeiro et al. 2009). O Brasil é um dos maiores consumidores de pesticidas do mundo visto que equiparadamente é um dos maiores produtores de alimentos, madeira, biocombustível e algodão (Schiesari et al. 2013). Em 2012 foram utilizados cerca de 105 bilhões de litros de pesticidas na produção agrícola de soja, milho, cana de açúcar, algodão, cítricos, café e 18

hortaliça, em uma área total de 95 milhões de hectares (Carneiro et al. 2012 e 2015). Com o aumento do agronegócio, nos últimos anos, os impactos causados pelo uso indiscriminado de pesticidas afetaram o solo, os lençóis freáticos, rios e o meio ambiente, podendo gerar também intoxicações agudas e crônicas na saúde dos trabalhadores rurais (Augusto et al. 2012 Carneiro et al. 2015). As regiões Sul (38,9%), Centro-Oeste (29,9%) e Sudeste (22,8%) são responsáveis por quase toda a produção agrícola do Brasil tanto para consumo interno como para exportação e por isso são os maiores consumidores de herbicidas do país (Spadotto, 2002). O consumo de pesticidas na região Centro-Oeste continua crescendo pelo aumento da área plantada de soja e algodão e a médio e longo prazo esses produtos destroem microrganismos, fungos e insetos tornando as pragas cada vez mais resistentes, exigindo doses cada vez mais altas (Rodrigues & Almeida, 1998; Ware, 1980). Nos últimos 37 anos o produto agrícola no Brasil cresceu a uma taxa média anual de 3,77% (Gasques et al. 2013). O advento de alimentos transgênicos, resistentes a algumas pragas, não resultaram na diminuição do uso dos compostos químicos, contribuindo para a produção de novas formulações, cada vez mais agressivas ao ambiente (Amarante Junior et al. 2002). Os pesticidas tem sido alvo de preocupação alarmante por parte dos diversos segmentos da sociedade, devido ao seu potencial risco ao ambiente (Cunha et al. 2005), uma vez que o uso indiscriminado (regido por fatores, como: uso inadequado, alta toxicidade, falta do uso de equipamentos de proteção e precariedade dos mecanismos de vigilância) pode gerar danos à saúde humana, animal e ambiental (Da Silva et al. 2008; Domingues Júnior et al. 2011). Suas principais vias de absorção são a dérmica, digestiva e respiratória. Alguns destes, como os organoclorados, permanecem armazenados nos tecidos de organismos vegetais e animais, incluindo o homem. Eles possuem grande estabilidade por serem lipossolúveis, o que os torna geralmente resistentes à degradação biótica ou abiótica (Carvalho et al. 2011). 2.1. Classificação dos pesticidas Os pesticidas são classificados como toxicológicos quando causam riscos a saúde humana e ao meio ambiente, sendo a DL50 de ratos tratados por via oral ou dérmica, a forma mais utilizada para essa classificação (Anvisa, 2016) (Tabela 1). De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa, 2012), os pesticidas também podem ser classificados quanto: à sua ação, grupo químico a que pertencem e toxicidade (Tabela 2).

19

Tabela 1. Classificação dos pesticidas quanto à sua toxicidade. Classe

Embalagem

Toxicidade

DL50 (mg/Kl)

I

Faixa Vermelha

Extremamente Tóxico

 

II

Faixa Amarela

Altamente Tóxico

5-50

III

Faixa Azul

Medianamente Tóxico

50-500

IV

Faixa Verde

Pouco Tóxico

> 500

Fonte: Anvisa (2016).

Tabela 2. Classificação dos pesticidas quanto ao seu mecanismo de ação e agrupamento químico. Mecanismos de ação

Inseticidas (controle de insetos)

Fungicidas (combate aos fungos)

Grupo químico Inorgânicos Extratos vegetais Organoclorados Organofosforado Carbamatos Piretóides sintéticos microbiais Inorgânicos Ditiocarbamatos Dinitrofenóis Organomercuriais Antibióticos Trifenil estânico Compostos Formilamina

Exemplos (produto/substâncias/agentes) Fosfato de alumínio, arsenato de cálcio Óleos vegetais Aldrin,* DDT,* BHC* Fenitrotion, Paration, Malation, Metil-paration Carbofuran, Aldicarb, Carbaril Deltametrina, Permetrina Bacillus thuringiensis Calda Bordalesa, enxofre Mancozeb, Tiram, Metiram Binapacril Acetato de fenilmercúrio Estreptomicina, Ciclo-hexamida Duter, Brestam Triforina, Cloraniformetam

20

Herbicidas (combate às plantas invasoras)

Desfoliantes (combate às folhas indesejadas)

Fumigantes (combate às bactérias do solo)

Rodenticidas/Raticidas (combate aos roedores e ratos) Moluscocidas (combate aos moluscos) Nematicidas (combate aos nematóideos) Acaricidas (combate aos ácaros)

Inorgânicos Dinitrofenóis Fenoxiacéticos Carbamatos Dipiridilos Dinitroanilinas Benzonitrilas Organofosforado Dipiridilos Dinitrofenóis Hidrocarbonetos halogenadosa Geradores de Metilisocianato Hidroxicumarinas Indationas Inorgânicos Carbamatos Hidrocarbonetos halogenados Organofosforados Organoclorados Dinitrofenóis

Arsenito de sódio, cloreto de sódio Bromofenoxim, Dinoseb, DNOC CMPP, 2,4-D, 2,4,5-T Profam, Cloroprofam, Bendiocarb Diquat, Paraquat, Difenzoquat Nitralin, Profluralin Bromoxinil, Diclobenil Roundup Diquat, Paraquat Dinoseb, DNOC Brometo de metila, cloropicrin Dazomet, Metam Formaldeídos Cumatetralil, Difenacum Fenil-metil-pirozolona, pindona (aquáticos) Sulfato de cobre (terrestres) Aminocarb, Metiocarb, Mexacarbato Dicloropropeno, DD Diclofention, Fensulfotion Dicofol, Tetradifon Dinocap, Quinometionato

Fonte: PERES et al. 2013.

21

2.2. Características e modo de ação dos herbicidas 2.2.1. Roundup® e Glifosato O Roundup Original® surgiu em 1970, e foi registrado pela primeira vez em 1974 para uso na Malásia e Reino Unido e, em 1976, para uso nos Estados Unidos. O Brasil recebeu sua primeira amostra para testes em 1972 e, em 1978, o produto (ainda importado) chegava ao país para ser comercializado (Monsanto, 2013). O Roundup® é um agroquímico pertencente ao grupo dos organofosforados e tem o glifosato (N-fosfonometil-glicina) como princípio ativo. Este contém sais de isopropilamina, uma amina surfactante - polioxietilenoamina (POEA) e água (Monsanto, 2013). O glifosato é um ácido orgânico fraco, formado por uma molécula de glicina (carbonila + amina) e outra de fosfonometil que resultam em diferentes cargas iônicas em função do pH do meio e é solúvel em água (Mensink & Janssen 1994) conforme representado na Figura 1. Este composto é pr

r n

sorv o p l r

lm nt

p lo lo m

o loro l p r

s pl nt s ( ol s

os t

pro u o

tr pto no n lu n

t l no r uz s nt s

os v r s)

os m r st m t os. Su

nolp ruv ls qu m to-3- os to s nt s (EPSPS) qu n l l n n t ros n

t

n on

prot n s

t l s or n l v

o

o s nt s

s nt s on ntr

tr nslo

o

r

-5-

n

os m no

loro l qu o

os

st mul

ux n s (Mensink &

Janssen 1994; Amarante et al. 2002; Galli & Montezuma 2005; Toni et al. 2006; Yamada & Castro, 2007).

Figura 1. Estrutura molecular do herbicida Glifosato.

A fórmula empírica do glifosato C3H8NO5P foi sintetizada pela primeira vez em 1950. Em 1970, J. E. Franz descobriu a propriedade de herbicida desta molécula (Braguini, 2005). Em 1991 o glifosato foi classificado como Grupo e pela Usepa (2016), sendo considerado não carcinogênico para humanos, com base na falta de dados convincentes que comprovem a 22

carcinogenicidade em estudos adequados. De acordo com a bula do Roundup Original®, ele possui Classificação Toxicológica III – Mediamente tóxico e Classificação do Potencial de Periculosidade Classe III – Produto Perigoso ao Meio Ambiente. Segundo a Monsanto, 2013 o Roundup® é o agroquímico mais vendido para o controle de plantas daninhas em pré-plantio nas lavouras e foi registrado em mais de 130 países. A maioria dos compostos organosfosforados é menos estável que os compostos organoclorados e são quebrados rapidamente por reações químicas ou bioquímicas, apresentando meia-vida quando livres no ambiente, e seus danos ambientais estão largamente relacionados à toxicidade aguda (Walker et al. 2006). Os organofosforados, mesmo em concentrações insuficientes podem alterar alguns processos celulares dos organismos expostos (Silva et al. 2013). Os solventes utilizados em formulações comerciais podem alterar as propriedades toxicológicas do produto, e alguns surfactantes podem apresentar ações irritativas de importância, não sendo uma ação do próprio princípio ativo (Itho, 2014). O principal produto da metabolização deste herbicida é o ácido aminometilfosfônico (AMPA) e sua meia vida variam de 3 a 130 dias, as características físico-químicas, do solo, condições climatéricas, presença de microrganismos podem sofrer variações de acordo com o meio ambiente. O curto efeito residual do glifosato e à sua forte característica de absorção, não atinge as águas subterrâneas, no entanto, pode contaminar águas superficiais através de seus padrões de uso aquático e erosões, por adsorver partículas do solo no escoamento superficial (Usepa, 1993). Os resíduos deste herbicida que permanece no solo são degradados por grande quantidade de microorganismos que o utilizam como fonte de energia e por isso esse composto apresenta uma meia-vida curta (Usepa, 1993; Amarante Junior et al. 2002; Andréa et al. 2004; Toni et al. 2006; Itho, 2014). O aumento do cultivo de plantas geneticamente modificadas aumentou o uso do glifosato no controle de ervas daninhas na agricultura, tornando-o o princípio ativo mais utilizado em pesticidas no mundo (Howe et al. 2004; Relyea & Jones, 2009). Em plantas e alguns microrganismos, o glifosato age como inibidor de enzimas essenciais na síntese de aminoácidos (Itho, 2014). Carbonari et al. (2012) concluíram que o glifosato ocasiona uma redução nos níveis de fenilalanina e tirosina em plantas de milho provocando um desequilíbrio nos processos que demandam a participação de enzimas e proteínas. Todos os pesticidas ontêm l m

s u pr n p o t vo su stân

s “ n rt s”

st n os

a estabilizar o princípio ativo e permitir que ele seja absorvido pelas plantas. Os órgãos reguladores e os fabricantes de herbicidas a base de glifosato fazem avaliações toxicológicas 23

com o glifosato isolado, e não com o herbicida em suas formulações comerciais (Mesnage et al. 2012). Segundo itho (2014) um estudo realizado com ratos criados em laboratório demonstrou que o Roundup Original® possui baixa toxicidade aguda, com DL50 oral igual a 5400 mg/kg de peso corpóreo e DL50 dérmica maior que 5000 mg/kg de peso corpóreo. Braguini (2005) em seu estudo sobre irritabilidade ocular de coelhos expostos ao Roundup Original® concluiu que esse composto foi levemente irritante, provocando congestão vascular e leve secreção na conjuntiva. Todos os surfactantes são considerados como ingredientes inertes e não necessitam de testes ou descrição na formulação do produto. Como consequência, fabricantes constantemente desenvolvem novos surfactantes, o que torna necessário testes de toxicidade em organismos não alvos, em ratas, por exemplo, a exposição aguda ao surfactante presente no Roundup® induziu um retardo no desenvolvimento ósseo, principalmente do crânio e ossos das patas (Braguini, 2005; Dallegrave et al. 2003; Relyea; Jones, 2009). As etilaminas são os surfactantes mais utilizados nas formulações do glifosato. Os compostos desse grupo de surfactantes são mais tóxicos do que o próprio princípio ativo (Amarante Junior et al. 2002; Lajmanovich et al. 2003; Mann; Bidwell, 1999). Segundo Amarante Junior et al. (2002) os surfactantes são agentes de atividade superficial, ou seja, são substâncias solventes que tendem a reduzir a tensão superficial do composto em que estão dissolvidas e diferentes formulações de Roundup® possuem diferentes surfactantes.

A

toxicidade do surfactante POEA utilizado no composto comercial Roundup® apresenta a toxicodade três vezes maior do que o glifosato. Com base nos estudos de toxicidade observa-se que a sensibilidade ao glifosato difere entre as espécies, no entanto, as diversas variações nas condições e nos desenhos experimentais (diferentes formulações comerciais de glifosato, diferentes tempos de exposição, diferentes substâncias surfactantes, quantidade de réplicas, condições abióticas no experimento, estágio de desenvolvimento das larvas, entre outros) dificultam a comparação e a definição de quais grupos ou espécies são mais tolerantes à contaminação (Relyea e Jones 2009; Mann et al. 2009, Simioni et al. 2013). Alguns produtos à base de glifosato possuem categorias de toxicidade I ou II para irritação ocular ou na pele. Segundo Giesy et al. (2000), as formulações de glifosato são consideradas praticamente não tóxicas para aves e mamíferos, moderadamente a praticamente não tóxicas à peixes e invertebrados e leve a moderadamente tóxicas para anfíbios.

24

2.2.2. Ácido 2,4-diclorofenoxiacético Em 1942 o ácido diclorofenoxiacético ou 2,4-D foi o primeiro herbicida orgânico desenvolvido pela indústria e durante a Segunda Guerra Mundial foi utilizado pela força aérea norte- m r

n

n

Gu rr

o V tn m

omo um

os

onst tu nt s

o “

nt

l r nj ”

juntamente com o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético e o pentaclorofenol foram aplicados como agentes desfolhantes. (Charles et al. 1996; Júnior et al. 2003; Suwalsky et al. 1996; Usepa, 2003; Who, 1989). Segundo Kirby (1980) a descoberta deste herbicida revolucionou a produção agrícola de culturas de arroz, aveia, cana-de-açúcar, milho, pastagens, sorgo e trigo da América do Norte e há mais de 60 anos é um dos pesticidas mais utilizados em todo o mundo. O aumento significativo do uso desse herbicida resultou na síntese de outros compostos, tais como o Dicamba, o Picloram e o Quinclorac, que são semelhantes ao 2,4-D e vêm sendo amplamente utilizados como herbicidas seletivos (Sterling; Hall, 1997). É um herbicida auxínico de ação sistêmica e seletiva, apresenta amplo espectro de controle de pragas e baixa persistência ambiental (Mithila et al. 2011; Tu et al. 2001; United States Environmental Protection Agency, 2006). É um ácido fraco geralmente aplicado em préplantio (ou pré-semeadura) para dessecação ou em pós-emergência em culturas de cereais (Rodrigues; Almeida, 2011). São amplamente utilizados na agricultura para controlar plantas daninhas de folhas largas exceto gramíneas ou coníferas, em culturas de cereais, cana-de-açúcar, pomares, controle florestal e plantas aquáticas (Mithila et al. 2011). O herbicida 2,4-D é um ácido orgânico de baixo peso molecular membro da família dos herbicidas clorofenoxiacéticos e é classificado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) como um herbicida hormonal do grupo fenoxiacético (Anvisa, 2001) conforme representado pela Figura 2. Os herbicidas fenoxiacéticos são compostos relativamente polares, com baixa pressão de vapor (Coquart e Hennion, 1993). A polaridade do 2,4-D está associada à forma como se apresenta, sendo que sua maior polaridade é obtida nas formas salinas (British Crop Protection Council, 1994).

25

Figura 2. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D ácido

A Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (International Agency of Research in Cancer - IARC) classifica os herbicidas ácidos fenóxidos como possivelmente carcinogênicos em humanos. A exposição a herbicidas fenoxiacéticos e seus contaminantes está associada a sarcomas e provoca efeito teratogênico, aumento da mortalidade fetal e efeitos reprodutivos em diferentes organismos (Sheet, 2000). O herbicida 2,4-D possui três vias de absorção: oral, dérmica e respiratória (Almeida e Rodrigues, 1988). A meia-vida desse composto varia entre 10 e 20h em organismos vivos, por exemplo, em aves a toxicidade deste herbicida é moderadamente tóxica e altamente tóxicas para os peixes. Os invertebrados aquáticos não são muito sensíveis ao 2,4-D, mas para abelhas expostas a moderadas doses de 2,4-D, já foram registrados severos problemas em seu sistema reprodutivo (Sheet, 2000). O 2,4-D apresenta estabilidade molecular e mesmo em baixas concentrações, seus efeitos sistêmicos são mais intensos e duráveis promovendo efeitos fisiológicos e bioquímicos similares aos do ácido indol-3-acético (AIA), principal auxina natural presente nas plantas e ainda hoje, existem lacunas de informações relativas aos efeitos à saúde humana e riscos ao ambiente (Vanneste; Friml, 2009). Este herbicida não apresenta persistência no solo, porém já foi detectado em reservatórios de água subterrâneo nos Estados Unidos e Canadá (Sarikaya & Yilmaz, 2003). As auxinas são hormônios responsáveis pela regulação e coordenação do metabolismo, crescimento e desenvolvimento das plantas e baixas concentrações induzem sintomas de fitointoxicação (Grossmann, 2010). A superconcentração de auxinas nos tecidos vegetais podem causar perturbações no crescimento celular ocasionando danos severos ao desenvolvimento e estrutura das plantas, deixando-as deformadas e retorcidas, com caules inchados e folhas e raízes 26

malformadas promovendo assim, o desequilíbrio na homeostase vegetal e nas interações com demais hormônios (Cobb, 1992; Fedtke; Duke, 2004). As formulações ácidas, sal ou éster presente no 2,4-D pode ser encontrado na forma líquida, pó solúvel, grânulos ou “pellets” (Tu et al. 2001). Todas as formulações podem variar de acordo com suas estruturas e podem apresentar alto risco de toxicidade às culturas vizinhas. Estas formulações são obtidas por meio da substituição do átomo de hidrogênio terminal da cadeia lateral da molécula, dessa forma podem alterar as características químicas da mesma, modificando suas propriedades e sua dinâmica no ambiente (Roman et al. 2007). Os ésteres são solúveis em lipídios e caracterizam-se por sua elevada pressão de vapor e maior atividade em plantas, pois se movimentam através da cutícula de maneira mais eficiente (Nice et al. 2004). As formulações ésteres são mais voláteis que as formulações amina ou colina e proporcionam um melhor controle das plantas daninhas, porém, uma maior toxicidade às plantas (Figura 3). As formulações ésteres não são mais comercializadas no Brasil devido aos possíveis problemas relacionados à volatilização desse composto (Roman et al. 2007).

Figura 3. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D éster

As aminas são as formulações mais utilizadas no mundo (Nice et al. 2004) sendo solúveis em água e após aplicação menos resistentes à lavagem pelas chuvas, essas características tornam a travessia da cutícula menos eficiente (Roman et al. 2007). As formulações amina, ou dimetilamina, provavelmente por possuir grupos químicos menores (dois grupos metila), pr s nt m m or “ xpos

o”

su

r

omp r

om s ormul õ s ol n (três rupos

metila) assim, a dimetilamina deve interferir mais intensamente com ânions presentes no sistema e menos intensamente com cátions (Figueiredo, 2015) conforme ilustrado na Figura 4.

27

Figura 4. Estrutura molecular do herbicida 2,4-D amina

A dinâmica ambiental do 2,4-D no solo é potencialmente móvel e de rápida degradação (sendo essa principalmente microbiana) o coeficiente de absorção (Koc) médio é de 20 mL g-1 para ácido e sais de amina, e 100 mlg-1 para ésteres. Esse herbicida tem uma meia-vida de aproximadamente dez dias no meio ambiente e sua lixiviação é minimizada pela remoção das plantas (Rodrigues; Almeida, 2011). O 2,4-D é considerado como um composto biodegradável onde a média de meia-vida do 2,4D em vegetais é de seis a sete dias e em águas ambientais a meia-vida é de duas a quatro semanas. Os formulados de 2,4-D na forma ácida, amina e éster, são metabolizados em compostos de menor toxicidade que, posteriormente, participam do ciclo do carbono. Assim sob circunstâncias normais, os resíduos de 2,4- D não são persistentes no solo, na água, ou na vegetação (Sheet, 2000). O herbicida Imazethapyr (IMZT) tem sido utilizado com frequência, no controle de plantas daninhas em países sul-americanos. Este produto pertence ao grupo químico das imidazolinonas e estão registrados no Brasil para uso exclusivo na cultura da soja, sendo utilizado em pré-plantio e incorporado (PPI) e em pré-emergência da cultura (Rodrigues & Almeida, 1995). Segundo Shaner et al. (1984), possui características de persistência no solo, o que para a cultura da soja é muito favorável, pois proporciona o controle residual das plantas daninhas durante o seu ciclo. Mas esta característica também constitui num risco para as culturas sucessivas à soja.

28

2.2.3. Interação entre os herbicidas O mecanismo de ação dos herbicidas e outros fitossanitários podem ocorrer tanto fora quanto no interior da planta e no momento anterior ou posterior ao da aplicação (Hatzios e Penner, 1985). Segundo Wang e Liu (2007) o sinergismo entre os pesticidas ocorre quando o efeito dos produtos aplicados juntos é maior que a soma de seus efeitos isolados. O antagonismo está dividido em quatro categorias e pode ser observado quando o efeito dos produtos aplicados juntos é menor que a soma dos seus efeitos em aplicações isoladas. O antagonismo bioquímico tem capacidade de diminuir a quantidade de herbicida que chega ao sítio de ação alvo. O antagonismo competitivo ocorre quando o agente agonista se liga ao sítio ativo e impede a ligação do herbicida. O antagonismo fisiológico ocorre quando os modos de ação entre os herbicidas aplicados se contrapõem. O antagonismo químico ocorre quando o composto é colocado em mistura e reage quimicamente com o herbicida alterando suas propriedades físico-químicas formando compostos menos ativos ou inativos. A forma aditiva ocorre quando a eficiência do produto é similar ou igual à aplicação de ambos individualmente (Hatzios; Penner, 1985; Green, 1989). Os herbicidas 2,4-D e glifosato são aplicados em pós-emergência nas culturas produzidas em larga escala e desempenham um papel importante na otimização da produção agrícola em todo o mundo. Ambos apresentam características hidrofílicas e são capazes de penetrar pelos “poros pol r s” das folhas (Wang 2007; Denis et al. 2015), são transportados para o interior da célula pelo AUX1 - auxin transporter protein 1 (Kleine-Vehn et al. 2006) e PHT – Phosphate transporter (Denis et al. 2015). Esses herbicidas são transportados na forma ionizada para tecidos e acumulam-se principalmente nas raízes, caules e folhas (Bromilow et al. 2015; Martin; Edgingtona, 1981). A complexidade das interações químicas entre os pesticidas e o uso indiscriminado de misturas induzem alterações nas propriedades físico-químicas e no comportamento das moléculas e podem causar impactos sobre o meio ambiente e à saúde humana. As misturas são utilizadas pelos produtores para reduzir custos de produção, para economia de trabalho e tempo e para reduzir os problemas relacionados à compactação do solo (Guimarães, 2014; Figueiredo, 2015). As combinações entre os herbicidas 2,4-D e glifosato tem sido alvo de discussão no Brasil, uma vez que não são formalmente regularizadas, porém, são comumente utilizados para aumentar a eficiência no controle das plantas daninhas tolerantes ou resistentes a um destes 29

mecanismos de ação. Sabendo-se disso inúmeros trabalhos foram desenvolvidos para verificar a eficácia da interação destes herbicidas (Flint; Barrett, 1989; Nalewaja; Matysiak, 1992; Wehtje; Walker, 1997; Santos et al. 2002; Costa, 2006; Costa et al. 2011; Takano et al. 2013; Costa et al. 2014). Em 2011 a Associação Brasileira dos Defensivos Genéricos (AENDA) publicou um parecer que aponta a necessidade da criação de projetos para ajustar a utilização de misturas no país. As combinações entre glifosato e IMZT apresentam danos sinérgicos ao DNA em organismos aquáticos, principalmente anfíbios, podendo ampliar seus efeitos nocivos sobre outras espécies não-alvo que habitam os agroecossistemas aquáticos. Anteriormente, a Usepa (1982) destacou que os efeitos tóxicos de um composto puro podem ser diferentes do produto comercial que transporta o ingrediente ativo. A presença dentro de formulações comerciais de compostos aditivos, também chamados de inertes, cuja identidade é frequentemente mantida em sigilo pelas empresas de fabricação, pode causar toxicidade diferente da do ingrediente ativo e parece ser um atributo distintivo na toxicologia de pesticidas (Belden et al. 2010; Brühl et al., 2011; Grisolia et al., 2004; Mann and Bidwell 1999; Nikoloff et al., 2014a, Soloneski et al., 2007; Soloneski e Larramendy 2010). 3. GENOTOXICIDADE E MUTAGENICIDADE DOS HERBICIDAS Os estudos de genotoxicidade analisam os efeitos dos agentes xenobióticos sobre o material genético, que podem resultar nas quebras em fita simples ou dupla do DNA promovendo também a formação de adutos (ligação covalente de um elemento ou composto químico com as bases nitrogenadas do DNA). Estas alterações ocorridas na molécula de DNA, quando não reparadas podem levar à mutações. Esses estudos também analisam os efeitos destas alterações nos produtos gênicos (RNAs, polipeptídeos e proteínas) os quais podem se refletir nas populações alterando sua fertilidade e sua capacidade de responder as mudanças ambientais entre outras (Grisolia, 2005). Sabe-se que a capacidade de reparo do DNA diminui com o passar do tempo e que a taxa de mutação de cada divisão celular aumenta com a idade do indivíduo (Grisolia, 2005). A maioria dos xenobióticos lançados ao ambiente constitui-se de agentes causadores de mutações gênicas e de alterações cromossômicas. Alguns destes são chamados de aneugênicos, pois atuam provocando alterações na distribuição dos cromossomos durante o processo de divisão celular, dando origem a aneuploidias. Outros, chamados de clastogênicos, induzem

30

quebras e produzem alterações na estrutura do cromossomo. Estas quebras e alterações podem ser detectadas através de estudos citogenéticos. Portanto, tendo um efeito clastogênico ou não, através de ensaios de genotoxicidade e citogenéticos, é possível proceder se à avaliação dos efeitos mutagênicos de um determinado composto, o que torna estes tipos de teste imprescindíveis nas avaliações de risco aos seres humanos e ao ambiente (Rabello-Gay; Rodrigues; Monteleone-Neto, 1991). Os pesticidas possuem em sua composição moléculas com poder oxidante que podem vir a formar radicais livres nos sistemas biológicos (Luz et al. 2003). Os radicais livres são moléculas altamente instáveis, que reagem com as estruturas celulares modificando a estrutura de lipídios e proteínas de membrana, alterando a permeabilidade da célula (Andrade Jr. 2005). Estas alterações podem chegar ao núcleo celular e atingir a dupla fita de ácido desoxirribonucléico, acarretando no desenvolvimento de danos no DNA, os quais podem desencadear doenças graves e até a carcinogênese (Ferreira, 1997). Além disso, vários pesticidas foram submetidos a testes e revelaram-se potencialmente genotóxicos e mutagênicos (Bolognesi, 2003). O dano citogenético induzido pelos pesticidas ocorre dependendo do grau de exposição, da quantidade, da natureza química e das possíveis combinações entre os pesticidas utilizados, além das características e condições do ambiente. Em humanos, sabe-se que um baixo grau de exposição está associado a resultados negativos para danos citogenéticos e, em contraste, resultados positivos são relacionados a populações com altos níveis de exposição. É importante ressaltar que a exposição crônica em baixas doses é cumulativa e também pode induzir tais danos (Bolognesi, 2003). Os agentes genotóxicos e mutagênicos interagem quimicamente com o material genético, formando adutos, alteração oxidativa ou mesmo quebras na molécula de DNA. Na grande maioria dos casos o dano é reparado pelo próprio organismo ou a célula é eliminada. Caso essa lesão seja fixada, provocam alterações hereditárias (mutações), que podem se perpetuar nas células filhas durante o processo de replicação, o agente é denominado mutagênico (Obe et al. 2004; White & Rasmussen, 1998). Embora ocorram mutações espontâneas, a maioria delas é induzida por agentes físicos, químicos ou biológicos, aos quais os seres humanos e outros organismos podem ser expostos (Calvielloa et al. 2005). A análise da genotoxicidade e mutagenicidade dos pesticidas é importante para acessar o risco genético não somente dos seres humanos expostos, mas de toda a biota nativa de determinado local. Desta maneira, a detecção e o entendimento das propriedades desses agentes 31

permitem avaliar os efeitos hereditários deletérios, ou mesmo letais aos organismos (Dallegrave, 2006). Os bioensaios de genotoxicidade e mutagenicidade são utilizados para determinar os efeitos dos poluentes na saúde da biota (Lam; Gray, 2003). Podem ser indicativos da exposição ou efeito de um xenobiótico quando há alterações bioquímicas, celulares e moleculares, fluidos corpóreos, tecidos ou órgãos em um organismo (Fuentes-Rios et al. 2005). Segundo Sarkar et al. (2006) os bioensaios são importantes para detectar alterações fisiológicas em curto prazo antes do aparecimento dos efeitos mais drásticos sobre as estruturas, o crescimento, o comportamento e reprodução do organismo. Desta forma, podem ser usados de forma preditiva, permitindo que sejam tomadas ações de biorremediação antes que ocorram danos ecológicos severos (Cajaraville et al. 2000). Os bioensaios avaliam antecipadamente mudanças nos altos níveis de organização biológica (população, comunidade ou ecossistema) e podem ser aplicados a uma ampla variedade de organismos vivos (Lam; Gray, 2003). Estes são responsáveis também, na avaliação dos efeitos de diferentes contaminantes, tais como metais, xenobióticos orgânicos e compostos organometálicos (Ross et al. 2002). Podem ser utilizados em estudos de biomonitoramento ambiental objetivando caracterizar áreas impactadas (Monserrat et al. 2007).

3.1. Ensaio Cometa Rydberg e Johanson em 1978 foram os primeiros cientistas que com o auxílio de um fotômetro quantificaram o dano ao DNA em células individualizadas. Uma vez que células individualizadas podem ser observadas, torna-se possível, com este ensaio, verificar se todas as células de uma determinada população têm a mesma quantidade de danos e ainda se, os mecanismos de reparo ao DNA, dentro de uma determinada população celular ocorrem na mesma frequência (Mitchelmore; Chipman, 1998; Olive; Banáth, Durand, 1990; Olive et al. 1992). Os locais do DNA que são suscetíveis ao processo de alquilação são mais sensíveis à degradação. Estes pontos, onde a depurinação está aumentada, transformam-se em pontos de quebras da fita de DNA sendo, portanto, visíveis com utilização do Ensaio Cometa (Hahn e Hock, 1999). O Ensaio Cometa a princípio foi desenvolvido para detectar efeitos genotóxicos em mamíferos, porém mostrou-se eficiente na detecção de substâncias genotóxicas em organismos do meio aquático. Este teste também demonstrou amplo emprego na área clínica em estudos de 32

reparo ao DNA no biomonitoramento ambiental e no monitoramento humano. Ao contrário de outros tipos de ensaios como o dos micronúcleos (MN), de aberrações cromossômicas (AC) ou de trocas de cromátides irmãs (SCE) que necessitam de células em proliferação para sua viabilidade, o ensaio cometa não necessita desta condição podendo ser realizado com qualquer tipo de célula nucleada (Padrangi et al. 1995; RojaS; Lopez; Valverde, 1999). A técnica do Ensaio Cometa, também conhecida como SCGE (Single-Cell Gel Eletrophoresis) é capaz de detectar dano ao DNA em células individualizadas podendo ser usado em experimentos in vitro ou ex vivo (Singh et al. 1988). O princípio desta técnica se baseia no fato de que o DNA da célula que não tiver dano migrará em conjunto formando um círculo. Os fragmentos menores tendem a migrar mais rapidamente do que os maiores. O dano ao DNA provocado por um agente genotóxico pode acarretar a formação de fragmentos de diversos tamanhos e esses fragmentos quando expostos a uma corrida eletroforética migrarão em velocidades diferentes, formando-se então a figura típica de um cometa, conforme ilustrado na Figura 5 (Olive; Banáth; Durand, 1990; Collins et al. 2008).

Classe 0

Classe 2

Classe 1

Classe 3

Classe 4

Figura 5. Imagens de nucleóides formando cometas com diferentes graus de dano ao DNA. O dano do DNA foi classificado em cinco classes (0 – 1 núcleo não danificado, 2 - dano mínimo, 3 - dano médio, 4 - máximo de dano). Fonte: Arcaute, CR (2014). O Ensaio Cometa é facilmente executado, apresenta custo relativamente baixo, com boa reprodutibilidade, rapidez e sensibilidade. Este teste é realizado sob condições alcalinas e permite a detecção de quebras de fita simples e fita dupla do DNA (Olive et al. 1992; Olive; Banáth, 1995). As quebras de fita simples, detectadas pelo método alcalino (SCGE), resultam de reações como: reparo por excisão de nucleotídeos ou de bases; excisão direta das proteínas estruturais do DNA por agentes químicos ou físicos; excisão seguida de intercalação de agentes 33

químicos na estrutura do DNA; ação de endonucleases ou topoisomerases entre outros (Mitchelmore; Chipman, 1998; Horväthova et al. 1998). Estima-se que com cerca de 200 quebras na fita de DNA, de uma célula, o teste mostre sua sensibilidade (Monteith, Vanstone, 1995; Sasaki et al. 1997; Rojas; Lopez; Valverde, 1999; Kumaravel et al. 2007). Já para Olive et al. (1998) podem ser detectados pelo ensaio a partir de 50 quebras em uma das fitas do DNA de células diplóides. As células nas quais se deseja verificar o dano ao DNA, são suspensas em agarose de baixo ponto de fusão (LMP) e então colocadas em lâminas de vidro para microscopia as quais foram previamente recobertas com uma camada de agarose normal. As lâminas contendo as células são então submetidas a uma corrida de eletroforese (Speit; Hartmann, 2003). Os danos impostos à molécula de DNA provocam um relaxamento desta condensação e ocasionalmente quebras na estrutura molecular (Rojas; Lopez; Valverde, 1999; Collins et al. 2008). As condições de pH da solução de lise e do pH do tampão de eletroforese onde ocorre o relaxamento da molécula de DNA influem no tipo de dano a ser visualizado, bem como nas características do cometa obtido. Sob condições neutras (pH 7,5) os cometas apresentam caudas mais densas enquanto que sob condições alcalinas (pH>10) são mais dispersas. Em meio alcalino as caudas são mais curtas e mais intensamente coradas, enquanto que em meio pouco alcalino (pH 10 –11), são mais longas e coram-se mais fracamente (Klaude et al. 1996). No Ensaio Cometa a lise das membranas tem o papel de remover os conteúdos celulares, com exceção do material nuclear. O DNA permanece bem condensado devido à presença de uma pequena quantidade de proteínas não histônicas. Porém, quando colocado na solução de eletroforese, a qual possui um pH maior que 13, a espiralização do DNA começa a relaxar a partir dos pontos de quebra da fita. Permitindo desta maneira que os mesmos sejam revelados pela eletroforese na sequência do teste (Yendle et al. 1997; Collins et al. 1997; Klaude et al. 1996). Espina e Weiss, 1995 relataram que embora as condições ideais para incrementar a sensibilidade do Ensaio Cometa dependam das células que serão utilizadas e do agente a serem testados os danos ao DNA podem ser detectados em curtas exposições ao agente genotóxico. Monteith e Vanstone (1995) detectaram dano ao DNA em hepatócitos de ratos expostos por um período de duas horas a dimetilnitrosamina (DMNA) e logo em seguida analisados. Segundo COLLINS et al. (1997, 2008) o DNA não migra em fragmentos como na eletroforese convencional, onde a distância percorrida é inversamente proporcional ao tamanho do fragmento. As distâncias entre as quebras originadas e detectadas pelo ensaio estão na ordem de 34

109 Da, muito além da faixa detectável pela eletroforese convencional. Nesta, o comprimento dos fragmentos está na ordem de 1 mm enquanto que a cauda de um cometa mede um centésimo deste valor. Para Olive, Banáth e Durand (1990) as quebras detectadas pelo ensaio ocorrem em virtude da digestão do DNA no processo de apoptose. Neste processo as células não apresentam um nucleóide típico, estando todo seu DNA fragmentado. Existem várias metodologias que podem ser empregadas na avaliação da extensão do dano ocasionado ao DNA. Uma das medidas utilizadas na avaliação deste dano é feita pela relação entre o raio do núcleo e a extensão da “ u ” (Tail length) formada pelo DNA em migração. Outra forma de medir o dano é a distribuição do DNA na cauda. A partir destas medidas outras foram sendo incorporadas na quantificação dos danos ao DNA (Kumaravel; Jha, 2006; Kumaravel et al. 2007). Os programas de análise de imagem são excelentes ferramentas que podem quantificar os danos sofridos pelo DNA sob diferentes parâmetros. No entanto, muitos destes programas são vendidos apenas junto com a marca específica de microscópio adquirido. Outros, apesar de funcionarem bem com qualquer equipamento têm como fator limitante o alto custo. Para contornar estes inconvenientes existem programas de domínio público que rodam sob diferentes plataformas e sob diversos sistemas operacionais (Linux, Windows 2000, NT, XP) que permitem a análise das imagens de cometas (Kumaravel; Jha, 2006; Kumaravel et al. 2007). As imagens obtidas do cometa têm uma forma complexa, porém estes programas são capazes de coletar uma grande quantidade de informações a partir destas imagens traçando uma série de informações (Lowell; Omori, 2008). O pro r m “Open Comet” é uma ferramenta de software (código aberto) que fornece análises automatizadas de imagens de ensaios de cometa s e foi desenvolvido para avaliar cometas produzidos no processo de eletroforese em gel de células individualizadas. Esse programa fornece parâmetros quantitativos representados pelos danos ocorridos ao DNA em cada célula. Dentre os parâmetros fornecidos pelo programa, os mais frequentemente utilizados são: comprimento da cauda, porcentagem de DNA na cauda e momento da cauda Olive (Lovell et al. 2008), sendo esse segundo, o que melhor representa a quantidade real de dano sofrido pela célula. Collins (2004), Kumaravel et al. (2009) relataram que os programas de análise de imagens de cometa são excelentes ferramentas que permitem quantificar os danos sofridos ao DNA sob diversos parâmetros. Estudos de genotoxicidade envolvendo anfíbios são essencialmente importantes para a detecção de espécies indicadoras de mudanças ambientais (Beiswenger, 1988, Weygoldt, 1989, 35

Vitt et al. 1990; Blaustein & Wake, 1995, Dalton, 2000) e sua sensibilidade talvez explique porque muitas vezes declínios populacionais ocorrem sem quaisquer alterações perceptíveis do habitat (Stuart et al. 2004). Embora existam muitos trabalhos no campo da ecotoxicologia e da genotoxicidade e seus protocolos estejam bem estabelecidos em estudos com humanos, ainda existe a ausência de uma padronização dos protocolos para muitos mamíferos e organismos aquáticos, tornando difícil o cruzamento dos dados encontrados em diferentes espécies ou mesmo dentro de uma mesma espécie (Frenzilli; Nigro; Lyons, 2008).

3.2. Teste do Micronúcleo O Teste do Micronúcleo foi desenvolvido por Schmid e colaboradores e em 1973 Heddle e colaboradores definiram que a avaliação do efeito mutagênico era realizada pela qualificação de estruturas conhecidas na hematologia como Howell-Joy (Matter & Schmid, 1971; Schmid et al. 1971; Nichols et al. 1972; Schmid, 1973). Este teste é amplamente utilizado para detecção de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos), e de agentes aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal) (Macgregor et al. 1987; Hayashi et al. 1994). Schmid, (1975) relatou que a formação do micronúcleo ocorre durante a anáfase quando as cromátides e os fragmentos cromossômicos acêntricos não são transportados pelas fibras do fuso para pólos opostos, enquanto que os fragmentos com centrômero são transportados para os lados opostos da célula. Após a telófase, os cromossomos sem danos são incluídos no núcleo de cada uma das células filhas. Elementos que não foram transportados pelo fuso também podem ser englobados pelos núcleos recém-formados. No entanto, alguns destes elementos, normalmente muito pequenos, não são incluídos nos novos núcleos e permanecem no citoplasma, constituindo as estruturas caracterizadas como micronúcleos. Os micronúcleos são corpúsculos extranucleares formados durante o processo da mitose, originam-se a partir de fragmentos cromossômicos ou de cromossomos que não foram incorporados ao núcleo de célula-filha durante a divisão celular (Albertini et al. 2000). Segundo Ferrari (1991) os efeitos de substâncias que provoquem quebras cromossômicas ou ainda afetem os componentes do fuso ou da região centromérica podem ser detectados a partir da presença de micronúcleos. O micronúcleo tem um tamanho 1/3 que não ultrapasse o tamanho do núcleo principal. Devem ainda, possuir bordas distinguíveis e com a mesma refringência do núcleo principal (Al-Sabti; Metcalfe, 1995; Ayllon; Garcia-Vazquez, 2000; Gustavino Et Al. 2001).

36

Para MAFFEI et al. (2002), CHUNG et al. (2002) e DING et al. (2003) o Teste do Micronúcleo é recomendado para a avaliação do potencial mutagênico de agentes físicos e químicos, para o registro de novos produtos químicos que entram no mercado mundial (RIBEIRO, 2003), no biomonitoramento de populações humanas ocupacionalmente expostos a agentes mutagênicos (Machado‐Santelli et al. 1994; Majer et al. 2001; Laffon et al. 2002; Bolognesi et al. 2004) na pesquisa de compostos inibidores de carcinogênese (Roy et al. 2003; Izzotti et al. 2001) e em estudos ecotoxicológicos (Gauthier et al. 1999; Lorente et al. 2002). É importante ressaltar que nem todos os produtos genotóxicos são clastogênicos, muitos induzem a formação dos micronúcleos por sua capacidade de afetarem o fuso (Heddle et al. 1991). Segundo Heddle et al. (1983) o teste micronúcleo é bastante sensível na quantificação da freqüência de anormalidades cromossômicas que surgem nos cromossomos humanos, esses fatores importantes em muitos tipos de câncer e no processo de envelhecimento. A formação dos micronúcleos, só pode ser observada após a ocorrência da divisão celular, a freqüência destas células depende do tempo que as mesmas levam para entrar no processo de divisão celular, do tipo de tecido, da espécie que está sendo usada para o teste e de condições ambientais. Portanto, são necessários um controle e conhecimento prévio da cinética de divisão da célula que será utilizada para o teste (Al-Sabti; Metcalfe, 1995; Fenech, 2000). A análise dos micronúcleos pode ser feita com células da medula óssea (medula óssea do fêmur); células esfoliadas dos epitélios: bucal (através de uma simples raspagem), dos brônquios (através da coleta do escarro), da bexiga urinária (pela coleta da urina, mas neste caso só a proveniente de indivíduos do sexo masculino, pois a urina coletada de indivíduos do sexo feminino pode apresentar células da mucosa vaginal) e de sangue periférico (análise de linfócitos e eritrócitos nucleados ou reticulócitos) (Ferrari, 1991). Evidencia-se que o teste só pode ser realizado com populações de células que tenham a capacidade de entrarem em divisão e preferencialmente que a análise seja feita após um único ciclo de divisão (Fenech, 2000). Durante o processo de contagem dos micronúcleos, são analisadas entre 1 mil e 2 mil células, com membranas citoplasmáticas e nucleares intactas, não sendo analisadas aquelas que estejam sobrepostas ou danificadas (Al-Sabti; Metcalfe, 1995). O teste do Micronúcleo não é capaz de detectar as não-disjunções mitóticas se estas não levarem à perda de cromossomos na anáfase, bem como não é possível detectar aberrações cromossômicas causadas por rearranjos, tais como translocações ou inversões, se estas não originarem fragmentos acêntricos. Desta forma o teste nestes casos apresenta uma subestimativa e falta de sensibilidade (Metcalfe, 1989). 37

4. BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL Os bioindicadores de qualidade ambiental são utilizados em estudos de avaliações de impacto ambiental devido sua interação com o meio ambiente e sua facilidade de absorção e acumulação de compostos xenobióticos (Younes, 2000). A resposta de cada organismo ao impacto ambiental é fortemente influenciada por suas condições fisiológicas, morfológicas estruturais e nutricionais assim como pelas condições físicas, químicas e biológicas do ambiente (temperatura, umidade, ventos e radiação) (Marteleto; Lomônaco; Kerr, 2004). A alta concentração de pesticidas, principalmente no ambiente aquático atingem níveis superiores de organização biológica, como comunidades e ecossistemas. Quando um estresse afeta as taxas de crescimento de uma população e a reprodução de novas espécies, ela se torna capaz de alterar a estrutura da comunidade (Agrofit, 2009). Os fenômenos estressores, tóxicos, citotóxicos, mutagênicos ou teratogênicos podem alterar o comportamento dos indivíduos dificultando seu desempenho na população causando impactos drásticos sobre a reprodução. A partir destes fatos, pode haver uma interferência no equilíbrio genético das populações, propiciando a vulnerabilidade dos organismos, o declive da diversidade e possivelmente a extinção da espécie (Dallegrave et al. 2006). Mundialmente, existe registros de níveis de contaminação em ambientes de água doce (córregos, lagos e áreas alagadas) que variam entre 1.4 a 7.6 mg a.e./L, porém, já foi observada em alguns estudos ecotoxicológicos uma diferença na tolerância interespecífica de alguns grupos de organismos utilizados como bioindicadores de qualidade ambiental (Edwards et al. 1980, Mann e Bidwell 1999, Giesy et al. 2000; Solomon e Thompson, 2003 e Thompson et al. 2004).

4.1. Anfíbios Anfíbios são considerados bioindicadores clássicos, pois apresentam uma série de características morfológicas, fisiológicas, de história de vida e reprodutivas que os tornam particularmente sensíveis a alterações ambientais (Schiesari et al. 2007). Os anfíbios são animais ectodérmicos, ou seja, utilizam a energia externa para regular a temperatura do corpo, apresentam ampla distribuição geográfica e estão divididos em três grupos distintos: as salamandras (Caudata), distribuídas, no hemisfério norte; as cobras-cegas (Gymnophiona), caracterizadas pela ausência de membros e os anuros (Anura), conhecidas como sapos, rãs e pererecas. Ao contrário de animais de sangue quente, como aves e mamíferos, não precisam de

38

grande quantidade de alimentos para gerar energia interna. São animais de extrema importância para o equilíbrio ecológico, uma vez que se alimentam de insetos e outros pequenos vertebrados e servem de alimento para muitas espécies de répteis, aves e mamíferos (Woehl Jr. 2008). A p l vr “ n

o” or

na-se do grego (anfi=duas e bio=vida) e significa vida dupla,

sendo uma fase aquática e outra terrestre. A fase aquática é caracterizada pelo desenvolvimento larval, cujos girinos se desenvolvem até atingir a vida adulta, que se dá em terra. Enquanto girinos, os anfíbios possuem brânquias por onde respiram retirando o oxigênio disponível na água. Quando adultos, geralmente há o desenvolvimento de pulmões, e a respiração passa a ser pulmonar (Woehl Jr. 2008). Existem evidências fósseis de 400 milhões de anos, que comprovam que os anfíbios evoluíram a partir dos peixes e foram os primeiros vertebrados a conquistarem o ambiente terrestre sendo classificados na classe Amphibia com três subclasses Labyrinthodontia, Lepospondyli e Lissamphibia. O fóssil mais antigo de um anfíbio em sua forma atual data de cerca de 250 milhões de anos, encontrado em Madagascar e ficou conhecido como Triadobatrachus (Woehl Jr.; Woehl, 2008). Os anfíbios anuros compreendem a maior biomassa de vertebrados e contribuem significativamente para a dinâmica trófica em muitas comunidades, tanto como presa, quanto predador (Blaustein et al. 1994; Blaustein; Kiesecker, 2002). Os anfíbios desde a década de 1980 vêm sofrendo uma queda de riqueza, sendo considerado desde então um dos grupos de animais mais ameaçados de extinção no mundo, principalmente no Brasil. Cerca de 30% das espécies de anfíbios estão classificadas como ameaçadas e aproximadamente 25% possuem dados insuficientes, incapazes de classificar essas espécies quanto ao nível de ameaça. Estima-se que 38 espécies já foram certamente extintas na natureza, porém, 120 espécies não foram encontradas nos últimos anos e podem também terem sido extintas (Iucn, 2014). Os girinos, fase larval de anfíbios são mais sensíveis a poluentes ambientais por possuírem características estruturais específicas que são ausentes nos adultos (Seixas Filho et al. 2003). O aparato oral é um exemplo, pois é uma estrutura presente apenas na fase larval dos anuros (Duellman; Trueb, 1994). As características principais do aparato oral são as papilas labiais, as fileiras de dentículos e o bico córneo na abertura da cavidade oral. Alterações nas estruturas orais podem provocar uma redução na eficiência de forrageamento dos organismos, pois estas estruturas são fundamentais para que os girinos possam se alimentar. A eclosão das desovas ocorre a partir do estágio 20 da tabela de Gosner (1960) neste estágio os girinos ainda não possuem movimentos natatórios e se alimentam das suas reservas nutritivas (saco vitelínico). No estágio 25 ocorre a absorção total do saco vitelínico, 39

encapsulação das brânquias e maturação de estruturas anatômicas utilizadas na captura do alimento. Nesta fase os girinos começam a se alimentar raspando com os dentículos existentes na boca materiais aderidos ao substrato e, com isso, liberam na água partículas de alimentos que serão posteriormente filtradas. A filtração é feita na medida em que aspiram à água, havendo a ingestão das partículas (Duellman; Trueb, 1986; Mcdiarmid, 1999). Da metamorfose a vida adulta, as alterações morfológicas são extremas: observa-se o desenvolvimento dos membros, a degeneração das brânquias, o desenvolvimento dos pulmões, a reabsorção da cauda, o desenvolvimento das glândulas demais, desenvolvimento dos olhos, a formação da boca e da língua e a diferenciação do trato digestório, com um rearranjo dos órgãos na cavidade visceral, sendo uma das mudanças mais drásticas que ocorrem durante a metamorfose. Neste período ocorre uma acentuada diminuição do intestino, além do desenvolvimento do estômago, degeneração da região oral do girino para a formação da boca e desenvolvimento da língua (Bahia, 2007). A classificação dos anfíbios envolvendo proposição de novos grupos de espécies, gêneros e famílias a realocações de famílias estão sofrendo constantes alterações. Além disso, novas espécies estão sendo constantemente descritas, por isso há grandes lacunas de conhecimento em relação às espécies brasileiras (Rossa-Feres et al. 2011). O conhecimento da dinâmica populacional dos anfíbios brasileiros é de extrema importância, pois anfíbios estão muito mais ameaçados que qualquer outro grupo de vertebrados (Stuart, 2004). Os anuros da família Hylidae ocorrem em todo o mundo, apresentam um grande número de espécies e podem ser encontradas com grandes variações quanto sua morfologia externa, coloração e reprodução, na maioria são arborícolas e de hábitos noturnos, apresentam discos adesivos bem desenvolvidos nas pontas dos dedos utilizados para fixação nos galhos e troncos e seu tamanho varia de 1,7 a 14,0 cm (Rossa-Feres et al. 1994). Segundo Kwet (1999) a família Hylidae apresenta ampla distribuição nas Américas, Austrália, Nova Guiné e Eurásia. Esta família está agrupada nas subfamílias Pelodryadinae, Phyllomedusinae e Hylinae. Faivovich et al. (2005) relatam que a subfamília Hylinae está dividida nas tribos Cophomantini, Lophiohylini, Hylini e Dendrospsophini apresentando 37 gêneros e 606 espécies. Já Phyllomedusinae engloba os gêneros Agalychnis, Cruziohyla, Hylomantis, Pachymedusa, Phasmahyla, Phrynomedusa e Phyllomedusa. Para Valdujo (2009), Dendropsophus minutus Peters, 1872 é uma espécie muito comum, apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo do norte da América do Sul até o Uruguai e Missiones na Argentina, da costa atlântica aos territórios do leste Boliviano. No Brasil ocorrem 40

em todas as regiões Nordeste, Norte, Centro-Oeste, Sudeste e Sul. São animais noturnos, os machos ativos apresentam vocalizações de alta intensidade, que facilitam a sua localização, r pro uz m m orpos ‟ u s m orr nt z

po

s r ons

r

omo um espécie com

ampla plasticidade na ocupação de microhábitats (Figura 6).

b

a

Figura 6. Macho de D. minutus vocalizando (a). Desova de D. minutus (b). Fonte: Carvalho, WF 2014. Essa espécie é conhecida como perereca-guria, perereca-rajada, possui tamanho variando de 20-26 mm, sendo a fêmeas maiores que os machos. A reprodução ocorre na estação chuvosa (setembro a fevereiro), a vocalização dos machos é utilizada para atrair as fêmeas m r mos ou t los ons

v r

t um

o r pro uz m-s sp

m

orpos

om mpl pl st

‟ u

s m

n o up

o

orr nt z

s n o port nto

m ro

t ts (Giovanelli,

2004; Ribeiro E Bertoluci, 2009). Dendrosophus minutus é uma espécie ons

r

“pou o pr o up nt ” m r l

o à su

conservação (Iucn, 2014). Segundo Hellawell (1986), essas características, unidas à sua taxonomia bem resolvida e a baixa capacidade de dispersão (no caso dos girinos), as tornam bons modelos bioindicadores de qualidade ambiental. Muitas análises baseadas na qualidade da água se dedicam a medição in situ, ou seja, refletem as condições físico-químicas momentâneas do orpo ‟ u

s rt n o o

tor t mpo os or n smos l ns r os (Queiroz et al. 2008).

A família Bufonidae, compreende em mais de 35 gêneros. O gênero Rhinella é o mais difundido e bem conhecido. Ocorrem nativamente em todos os continentes, exceto Austrália e Antártica, habitando ambientes variados, de áreas áridas a florestas úmidas (Cogger e Zweifel, 1998). A espécie Rhinella arenaum mede entre 8 a 11,5 cm, possui glândulas parotóides atrás dos olhos e glândulas de veneno espalhadas pela pele, o que confere um caráter áspero. A 41

coloração varia do marrom claro até quase branco Figura 7. As fêmeas são mais escuras e possuem o dorso pontuado por manchas esbranquiçadas. Ocorre na planície costeira do sul do Brasil (Santa Catarina e Rio Grande do Sul), no litoral do Uruguai e em grande parte do litoral e interior do norte da Argentina, alcançando ao norte até a Bolívia, nas províncias de Cochabamba, Chuquisaca, Santa Cruz e Tarija (Frost, 2004). É uma espécie comum na região da planície costeira e pode ser encontrado freqüentemente dentro de pátios de residências, sempre próximo á iluminação artificial, capturando insetos. Pode ser visto também na beira da praia, muito próximo ao mar, inclusive em atividade reprodutiva nas pequenas e rasas poças d´água estagnada formadas após chuvas fortes. A desova consiste num cordão gelatinoso com muitos ovos de coloração preta. Alimentase de insetos, minhocas, isópodos e pequenos vertebrados (Achaval & Olmos, 2003). Vários estudos evidenciaram que as larvas de R. arenarum podem ser consideradas como uma matriz biótica apropriada para a avaliação e quantificação de toxicidade induzida por pesticidas e outros poluentes e para estimar a instabilidade genômica em ambientes aquáticos. Entre estes podem ser incluídos vários herbicidas, tais como 2,4-D, atrazina, glufosinato-amónio, bispyribac-sódio, flurocloridona, glifosato, metsulfurão-metilo e piclorão (Usepa, 2017).

a

b

Figura 7. Rhinella arenarum (a). Girino de R. arenarum estágio Gosner 37 (b). Fonte: Buckingham, M. 2013. 4.2. Declínio de anfíbios A região neotropical apresenta os menores índices de estudos ecotoxicológicos sobre o efeito dos pesticidas em espécies de anfíbios (Schiesari et al. 2007). Os anfíbios são sensíveis à

42

exposição a contaminantes, sendo considerados bons bioindicadores para monitoramento da qualidade da água (Besten; Munawar, 2005). O Brasil abriga aproximadamente 17% de espécies de anfíbios endêmicas do mundo e a maior taxa de declínio populacional (Figueiredo e Rodrigues 2014; Frost, 2016; Toledo et al. 2010). A taxa de declínio dos anfíbios em regiões de endemismos chega a ser 211 vezes maior que a predita pelo registro fóssil (Brunelli et al. 2009; Toledo et al. 2010). Existe pouca informação sobre os efeitos dos pesticidas em espécies de anfíbios, porém, evidências sugerem que o declínio de anfíbios esteja relacionado com o uso intensivo de pesticidas (Relyea, 2005). Estudos de impacto sub-letal de pesticidas em populações de anfíbios são escassos, apesar do uso de xenobióticos (sozinhos ou associados a outros fatores) ser considerado, nas últimas décadas, o principal fator responsável pelo declínio de anfíbios (David et al. 2012; Lavorato et al. 2013). Característica como pele bastante permeável, reprodução e os estágios larvais dependentes do ambiente aquático tornam os anfíbios anuros altamente vulneráveis à contaminação química (Hayes et al. 2010; Silva et al. 2013). O declínio das populações de anfíbios está relacionado com o aumento dos poluentes ambientais, a influência das alterações climáticas, fragmentação do habitat, exposição à radiação ultravioleta, introdução de espécies exóticas e principalmente as alterações ambientais causadas pelo homem (Davidson et al. 2001; Blaustein; Kiesecker, 2002; Brunelli et al. 2009; Toledo et al. 2010; Woehl Jr.; Woehl, 2008; Hayes et al. 2010). A redução da riqueza de espécies também está relacionada ao uso indiscriminado e intensivo de compostos químicos (BrunellI et al. 2009, Relyea, 2005). Os testes de toxicidade são exigidos pelo Ibama e visam à proteção de espécimes da fauna brasileira, no entanto, observa-se de forma clara que a maior atenção dos órgãos de proteção ambiental se dá aos testes com indivíduos adultos, fazendo com que a legislação não atenda aos diferentes requisitos e ameaças à fase larval do grupo. Assim, subentende-se que as r tr z s norm s r

s p r prot

o

orpos ‟ u (Conama 357) não se adequam e não

estão de acordo com as necessidades ecológicas dos girinos, as quais se diferem muito das condições imposta aos adultos. (Relyea 2005, 2006, 2012; Jones et al. 2010, 2011). A exposição a poluentes ambientais pode causar falhas no desenvolvimento e reprodução, mesmo que em doses sub-letais que não apresentem efeitos fisiológicos adversos e consequências sobre a saúde (Hayes et al. 2010). O efeito de poluentes em girinos é menos conhecido em relação aos anfíbios adultos, pois as larvas dos anuros são menos visíveis e ao contrário dos adultos, não possuem vocalização. 43

Girinos de várias espécies ainda não foram descritos, o que dificulta ainda mais o estudo aprofundado destes organismos (Mcdiarmid, 1999). As variações climáticas afetam os efeitos dos contaminantes, pois a meia-vida dos poluentes químicos é dependente de fatores, como temperatura, pH, incidência de luz, humidade, etc., que podem reduzir o impacto do composto químico, ou transformar os poluentes em formas mais prejudiciais ao meio ambiente (Hayes et al. 2010). Alterações na precipitação e temperatura afetam a fenologia (fenômenos periódicos de seres vivos em relação às condições ambientais) e os altos índices pluviométricos podem antecipar o período reprodutivo de anfíbios anuros (Blaustein; Kiesecker, 2002). Os efeitos sub-letais que podem afetar o crescimento e desenvolvimento, comportamento, fisiologia e anatomia dos anfíbios são provocados devido a exposição desses indivíduos a radiação ultravioleta (UV-B) (Blaustein; Kiesecker, 2002). Os declínios de anfíbios podem variar espacial e temporalmente acarretando a perda de cinco fatores principais como: a) prejuízos na agricultura, visto que os anfíbios proporcionam um equilíbrio ecológico e evitam surtos de pragas agrícolas; b) acúmulo de matéria orgânica nos orpos ‟ u j qu os girinos auxiliam na alimentação e redução da mesma nos reservatórios de água; c) prejuízo no abastecimento de água para a população e encarecimento do tratamento da mesma para consumo; d) desequilíbrio das redes tróficas, já que os anfíbios são a base de alimento de diversos organismos terrestres e aquáticos proporcionando o controle ecológico e se alimentam de uma diversidade de invertebrados, inclusive de insetos vetores de doenças; e) prejuízos na indústria farmacêutica, pois muitos compostos químicos produzidos pelas glândulas cutâneas dos anfíbios estão sendo utilizadas para a produção de fármacos no Brasil e no mundo (Camargo, 2005; Toledo et al. 2010). A ont m n

o

orpos ‟ u próx mos às áreas agrícolas geralmente aumentam

durante a estação chuvosa, período de reprodução da maioria das espécies de anfíbios e muitas espécies usam parte de seu ciclo de vida lagoas temporários e pequenos cursos

‟ u s

adjacentes às áreas agrícolas prejudicando o período reprodutivo e desenvolvimento larval (David et al. 2012; Hayes et al. 2010; Howe et al. 2004). Na estação chuvosa os resíduos agrícolas pr s nt s no solo po m s r

rr

os p r

orpos ‟ u sendo assim, é possível que

estes poluentes possam se dissolver na água afetando gravemente a população de anfíbios (David et al. 2012; Walker et al. 2006). De acordo com Walker et al. (2006), as principais rotas de absorção de poluentes orgânicos por anfíbios anuros são a alimentação e a pele, através dos poluentes dissolvidos ou suspensos na água. Após a absorção, a substância é transportada para diferentes compartimentos do corpo através do sangue e da linfa (no caso de vertebrados). 44

O glifosato tem sido testado em algumas espécies de anfíbios que, coletivamente, representam menos de 0,2% das espécies existentes no mundo. Para alcançar um conhecimento real dos impactos do glifosato, é necessário expandir informações gerais sobre os anfíbios, tanto taxonomicamente quanto geograficamente. A redução na sobrevivência das larvas decorrente da exposição ao glifosato foi observado por Simioni et al. (2013), Figueiredo e Rodrigues (2014) e Costa el al. (2015) em larvas de Physalaemus albonotatus, P. centralis e P. cuvieri. Nos últimos trinta anos, populações de anfíbios vêm sofrendo grande declínio ou mesmo sendo extintas; quase a metade das espécies está enfrentando algum decréscimo populacional (Blaustein; Bancroft, 2007). De acordo com Hayes et al. (2010), pesticidas e misturas de compostos químicos podem atrasar e/ou inibir a metamorfose dos anfíbios, e a completa inibição da metamorfose irá impactar negativamente a reprodução. Há várias razões pelas quais os anfíbios são sensíveis à contaminação de ambientes aquáticos, entre elas o desenvolvimento das larvas de anfíbios até sua vida adulta ser regulado por hormônios, que podem ser afetados por compostos que promovem a desregulação endócrina, além de dispenderem parte de suas vidas na água, estando assim expostos a contaminantes presentes na água e por sua capacidade de absorver compostos químicos através da pele (Besten; Munawar, 2005).

4.3. Peixes A biota aquática é frequentemente exposta a uma grande quantidade de substâncias tóxicas oriundas de descarga de lixos tóxicos provenientes de efluentes industriais, processos de drenagem agrícola, derrames acidentais de produtos químicos e esgotos domésticos entre outros (Rashed, 2001; Van Der Oost et al. 2003). As comunidades biológicas de ecossistemas aquáticos são formadas por organismos que apresentam adaptações evolutivas e limites de tolerância a diferentes alterações ambientais (Alba-Tercedor, 1996). Estas comunidades refletem a integridade física, química e biológica dos ecossistemas, com isso o monitoramento biológico constitui-se uma ferramenta útil na avaliação das respostas destas comunidades a modificações nas condições ambientais (Au, 2004; Van Der Oost et al. 2003). Os peixes são bioconcentradores de poluentes ambientais e excelentes bioindicadores em estudos de toxicidade, pois, detectam precocemente a presença de agentes tóxicos, mesmo a baixas concentrações, nos ecossistemas aquáticos (Vignardi, 2012). De acordo com Karr (1981), Ramelow et al. (1989) e Schulz & Martins-Junior (2001) a biodiversidade de peixes distribuídos 45

em diferentes níveis tróficos apresentam vantagens em testes de toxicidade, tanto in vitro como in vivo, por serem abundantes, de fácil identificação taxonômica, possuem eritrócitos nucleados e são importantes veículos de transferência de contaminantes do ambiente aquático a populações humanas. As informações sobre a genotoxicidade de xenobióticos em comunidades de peixes são importantes tanto para a conservação do ecossistema como para a saúde humana (Van Der Oost Et Al. 2003). A mobilidade, estilo de vida, mudanças na taxa de crescimento e na maturação sexual na comunidade de peixes são fatores que refletem no grau do distúrbio ambiental do ecossistema aquático (Al-Sabti & Metcalfe et al. 2007). As modificações na estrutura da comunidade de peixes, tais como riqueza e abundância, também podem refletir os efeitos de vários estressores de integridade da biota aquática (Fausch et al. 1990). O uso de peixes como modelo animal em testes de toxicidade tem aumentado principalmente devido algumas características como tamanho do corpo, a existência de uma padronização e de técnicas válidas para as culturas em laboratório, ciclo de vida relativamente rápido, grande quantidade de informações existentes relacionadas aos atributos biológicos e toxicológicos básicos (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Miracle & Ankley, 2005). Os peixes podem ser utilizados em bioensaios para testar substâncias químicas que são potencialmente teratogênicas e carcinogênicas para o homem e normalmente respondem aos compostos tóxicos em vias similares aos grandes vertebrados. A utilização desses organismos como um sistema bioindicador tem apresentado resultados satisfatórios na avaliação dos efeitos de químicos contaminantes no meio ambiente aquático (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Matsumoto & Cólus, 2000; Grisolia, 2009). O ensaio cometa tem sido aplicado em vários estudos utilizando eritrócitos de várias espécies de peixes, devido à sensibilidade das células sanguíneas destes animais aos efeitos genotóxicos. Esta técnica também foi aplicada em outros tipos celulares, como hepatócitos, células branquiais, renais e intestinais (Souza e Fontanetti, 2007). Segundo Miracle & Ankley, 2000 as análises toxicológicas em peixes são frequentemente utilizadas em programas de registros de novos pesticidas nos Estados Unidos, onde os critérios de qualidade da água no meio ambiente e testes para classificação de químicos específicos, como os desreguladores endócrinos, também são analisados. A escolha da espécie de peixe como bioindicador dependerá do conhecimento do poluente no ambiente aquático, se ocorre o depósito nos sedimentos, ou se permanecem na coluna de água, assim como a biologia e comportamento do animal. No caso de alguns compostos como os organoclorados, que sofrem biomagnificação

46

em cadeia ecológica, os peixes carnívoros são utilizados como melhores bioindicadores para avaliação do potencial de bioacumulação da substância (Grisolia, 2009). Segundo Ruffino (1999) algumas espécies de peixes são mais sensíveis a alterações nas características químicas e físicas da água, as quais podem ser causadas por contaminações de vários tipos de poluentes orgânicos ou inorgânicos ou variações naturais. Os distúrbios ambientais podem ser refletidos diversos níveis da organização biológica dos peixes as respostas variam de acordo com o grau de plasticidade fenotípica que cada grupo possui. Esta plasticidade somática (ou fenotípica) pode ser definida como os limites da variação morfológica e fisiológica na expressão de um determinado genótipo quando exposto a alterações ambientais. Como os peixes são bioacumuladores, o constante monitoramento em áreas de risco é fundamental para que não ocorra contaminação da população humana. A família Poeciliidae é classificada dentro da ordem Cyprinodontiformes e compreende 299 espécies de peixes de diversos tamanhos e está distribuído principalmente em clima é tropical de água doce ou salobra nos continentes americano e africano (Rosen e Bailey, 1963). Esta família divide-se em três subfamilias: Poeciliinae (220 espécies), Procatopodinae (78 espécies) e Aplocheilichthynae (uma espécie) e a maioria das espécies apresentam fertilização interna (Parenti, 1981; Meyer e Lydeard, 1993). Os machos da subfamília Poeciliinae possuem um órgão copulador exclusivo denominado gonopódio, formado a partir de modificações nos raios 3, 4 e 5 da nadadeira anal e estão amplamente distribuídos nas Américas e Caribe (Parenti, 1981; Lucinda e Reis, 2005). Algumas espécies da subfamília Poeciliinae compreendem espécies de peixes de aquário conhecido popularmente como guppies e já foram utilizados em estudos experimentais sobre seleção natural e sexual (Endler, 1983; Houde, 1997; Schluter et al. 1998; Hamilton, 2001) e em estudos comparativos de história de vida e evolução (Grove e Wourms, 1994; Arias e Reznick, 2000; Reznick et al. 2007). Dentro da subfamília Poeciliinae pode-se destacar a tribo Cnesterodontini, composta por três gêneros (Phallotorynus, Phalloceros e Cnesterodon) e autóctone Sul-americana, com distribuição restrita à região sudeste da América do Sul (Argentina, Brasil, Paraguai e Uruguai) (Lucinda e Reis, 2005). A tribo Cnesterodontini é conhecida pelo gênero Cnesterodon (Garman, 1895), composto por 11 táxons validos e 10 espécies descritas de peixes pequenos (4-5 cm) que distribuem- se pelo Sul da América do Sul, nas bacias do Alto Araguaia, sistema Paraná-Paraguai, Bacia do Uruguai e ao longo das drenagens costeiras de São Paulo até a Argentina, bem como pequenas drenagens do Oeste Argentino (Lucinda, 2005). As espécies deste gênero são conhecidas como 47

rr u n os po s

um

sp

vvp r

s êm s

m “ rr u s” no p r o o

gestação, apresentam um elevado grau de endemismo por possuir ao menos oito espécies associadas a regiões específicas e com distribuições muito restritas (Lucinda, 2003). Embora a taxonomia deste grupo pareça estar bem resolvida, o conhecimento sobre as relações filogenéticas, biogeografia e o grau de diversidade intra e intergenérica é escasso (Lucinda e Reis, 2005). A espécie Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842) é um poecílido pequeno de até 5cm de comprimento, tem hábitos onívoros e se alimenta basicamente de zooplancton, larvas de insetos e algas, é comumente conhecido na Argentina como "Madrecita" Figura 8. Sua distribuição cobre a maior parte do Rio de La Plata e da bacia do Atlântico na Argentina, Brasil e Uruguai (Rosa & Costa, 1993). Esta espécie é caracterizada por sua tolerância às variações físico-químicas da água, portanto é comum encontrá-la em ambientes alterados (Bistoni et al. 1999; Scasso et al. 2001; Hued & Bistoni, 2004; Teixeira De Mello, 2007).

Figura 8. Macho de Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842). Fonte: Carvalho, WF 2017.

48

5.

OBJETIVOS

5.1.

Geral:

- Avaliar os efeitos genotóxicos e mutagênicos de herbicidas em biondicadores de qualidade ambiental. 5.2. Específicos: - Avaliar o efeito agudo de formulações de Roundup®, 2,4-D e Imazethapyr em organismos aquáticos, via ensaio cometa e teste do micronúcleo. - Determinar a CL5096h do Roudup Original® com a utilização do teste de toxicidade aguda em girinos de D. minutus. - Monitorar variáveis como pH, temperatura, quantidade de oxigênio dissolvido e de solutos totais nos experimentos de toxicidade aguda realizados com larvas de anfíbios anuros. - Determinar a CL5096h do Pivot® para girinos de R. arenarum. - Determinar a CL5096h dos herbicidas Herbifen Super®, Weedar Full® e Dedalo Elite® para Cnesterodon decemmaculatus. - Analisar as interações genotóxicas de 5% e 10% dos herbicidas Credit ® e Pivot® em R. arenarum. - Analisar as interações genotóxicas de 5% e 10% dos herbicidas Credit® e de Herbifen Super® (2,4-D éster) Weedar Full® (2,4-D amina) e Dedalo Elite® (2,4-D ácido) em C. decemmaculatus.

49

6.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Achaval, F. & Olmos, A. 2003. Anfibios y reptiles del Uruguay. 2a edição. Montevideo, Graphis. 136 pp. Agrofit. Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários. São Paulo: Agrofit, 2000. p. 1 e 2. Disponível em Acesso em: 19 janeiro. 2018. Alba-Tercedor, J. Macroinvertebrados acuaticos y calidade de las aguas de los rios. IV Simposio del Agua en Andalucia (SIAGA). Almeria: vol. II: 203-213, 1996. Disponível em: http://www.ephemeroptera-galactica.com/pubs/pub_a /pubalbaj1996p203.pdf, Acesso em 20 jun 2017. Amarante Junior Ozelito Possidônio de et al. Glifosato: propriedades, toxicidade, usos e legislação. Quím. Nova São Paulo v. 25 n. 4 p. 589-593. 2002. Almeida, F. S.; Rodrlgues, B. N. Guia de herbicidas. 2.ed. Londrina: Almeida e Rodrigues, 1988. P.75- 217. Anvisa - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Critérios para a classificação toxicológica. Disponívelem:. Acesso em: 03 fev. 2016. Arias, Ai-Li, e David Reznick. 2000. “L V r t on on t T m o L v rn nt

H story o P llo ros u om ul tus: A Nov l F m ly Po l ”. Copeia 2000 (3): 792–98.

Au D. W. T. 2004. “T Appl t on o H sto-Cytopathological Biomarkers in Marine Pollution Mon tor n : A R v w”. Marine Pollution Bulletin 48 (9–10): 817–34. https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2004.02.032. Astm. Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates and amphibians. Designation: E-729 – 96. 2002. Bahia, V. R. L. De O. Morfologia e enzimologia do sistema digestório dos girinos de rã-touro (Rana catesbeiana) durante o desenvolvimento e metamorfose. 2007.164 f. Tese (Doutorado em Aquicultura) - Centro de Aquicultura da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Jaboticabal, 2007. Beiswenger, R.E. lntegrating anuran amphibian species into environmental assessment programs, p.159-165. ln: Szaro, R.C., Severson, K.E. & D.R. Patton (Eds). Management of Amphibians, Reptiles, and Small Mammals in North America: Proceedings of the Symposium. Arizona, Usda Forest Service, General Technical Report RM-166, 458p. 1988. Besplug, Jill, Jo y F lkowsk P ul Burk I or Kov l uk Ol Kov l uk. 2004. “Atr z n Induces Homologous Recombination but Not Point Mutation in the Transgenic Plant-Based B omon tor n Ass y”. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 46 (3): 296– 300.

50

Besten, P. J. den, e M. Munawar. 2016. Ecotoxicological Testing of Marine and Freshwater Ecosystems : Emerging Techniques, Trends and Strategies. CRC Press. https://doi.org/10.1201/9781420037500. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Informações médicas de urgência nas intoxicações por produtos agrotóxicos: clorofenóxis. Brasília. Disponível em: www.anvisa.go.gov.br. Acesso em junho 2017. Bistoni M. A., A. Hued, M. Videla & L. Sagretti (1999). Water quality effects on fish communities of the central part of Argentina. Revista Chilena de Historia Natural 72:325-335. Braguini, W.L. Efeitos da deltametrina e do glifosato, sobre parâmetros do metabolismo energético mitocondrial, sobre membranas artificiais e naturais e exterimento in vivo. 2005. 193 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Pós Graduação em Ciências Bioquímicas, Universidade Federal do Paraná, UFP, Curitiba. 2005. Bromilow, R.H.; Chamberlain, K. The herbicide glyphosate and related molecules: physicochemical and structural factors determining their mobility in phloem. Pest Management Science, Sussex, v. 56, p. 368-373, 2015. Blaustein, A.R., And Wake, D.B. Declive de las poblacíones de anfíbios. Investigacíon y Ciência 1995, 8-13. 1995. Blaustein, A. R.; Kiesecker, J. M. Complexity and conservation: lessons for the global decline of amphibian populations. Ecology Letters, v. 5, p. 577-608. 2002. Boone, M. D., D. Cownan, C. Davidson, T. B. Hayes, W. A. Hopkins, R. A. Relyea, L. Schiesari, And R. Semlistch. Evaluating the role of environmental contamination in amphibian population decline. In: Gascon, C., J. P. Collins, R. D. 2007. Carneiro F.F.P.W; Rigotto R M; Augusto L G S. Rizzolo A; Muller N M; Alexandre V P.; Friedrich K; Mello M.S.C. Dossiê ABRASCO – Um alerta sobre os impactos dos agrotóxicos na saúde. Parte 1 - Agrotóxicos Segurança Alimentar e Nutricional e Saúde. Rio de Janeiro: Abrasco 2012. Carvalho, S. L. Vieira, And R. P. Bastos. Conservation biogeography of anurans in Brazilian Cerrado. Biodiversity and Conservation 16: 997 – 1008. 2007. Carneiro F. F. et al. Dossiê ABRASCO: um alerta sobre os impactos dos pesticidas na saúde. 2015. Cobb A.H. Auxin-type herbicides. In: Chapman e Hall. Herbicides and Plant Physiology, London, UK, p. 82–106, 1992. Costa, A.G.F. Determinação da deriva da mistura 2, 4-D e glyphosate com diferentes pontas de pulverização e adjuvantes. 2006. 94 p. 2006. Tese de Doutorado. Tese (Doutorado em Agricultura)–Universidade Estadual de São Paulo, Botucatu, 2006. Costa, N.V. et al. Eficácia do glyphosate e 2,4-D no controle de espécies de trapoerabas (Commelina spp.). Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n.5, p. 718-728, set/out. 2011.

51

Costa, A.G.F. et al. Adjuvantes na deriva de 2,4-D + glyphosate em condições de campo. Ciência Rural, Santa Maria, v. 44, n. 3, p. 387-392, mar. 2014. Colasso C. G.; Diaz M. B. Estudo dos aspectos toxicológicos à saúde humana em relação ao praguicida organofosforado metamidofós e sua situação regulatória no Brasil e no mundo. Rev. Inter Revista de Toxicologia Risco Ambiental e Sociedade v. 4 n. 3 ISSN 1984-3577. 2015. Collins, Andrew R., Amaia Azqueta Oscoz, Gunnar Brunborg, Isabel Gaivão, Lisa Giovannelli, M r n Krusz wsk C t r n C. Sm t Ru ol St t n . 2008. “T Com t Ass y: Top l Issu s”. Mutagenesis 23 (3): 143–51. https://doi.org/10.1093/mutage/gem051. Conama 357. Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução nº 357, de 17 de Março de 2005. Publicada no DOU nº 053, de 18/03/2005. Pp 58 – 63. 2005. Charles, Jeffrey M., Helen C. Cunny, Ronald D. Wilson J m s S. Bus. 1996. “Comp r t v Subchronic Studies on 2,4-D lorop noxy t A Am n n Est r n R ts”. Fundamental and Applied Toxicology 33 (2): 161–65. https://doi.org/10.1006/faat.1996.0153. Cunha, Anna Claudia, Fernanda Menezes da Paixão, Maria Cecília B. V. de Souza, e Vitor Fr n s o F rr r . 2006. “Clor to so núr o lor to núr o: sp tos r s pl õ s m s nt s or ân ”. Química Nova 29 (3): 520–27. https://doi.org/10.1590/S010040422006000300021. Cunha, J. P. a. R. M. M. T x r J. R. Coury L. R. F rr r . 2003. “Av l o str t s p r r u o rv rotóx os m pulv r z õ s r ul s”. Planta Daninha 21 (2): 325–32. https://doi.org/10.1590/S0100-83582003000200019. Dallegrave, Eliane, Fab n D G or o M nt s R r o So r s Co l o J n n Dr w ns Pereira, Paulo Roberto Dalsenter, e Augusto Langeloh. 2003. “T t r to n pot nt l o t herbicide glyphosate-Roundup® n W st r r ts”. Toxicology Letters 142 (1): 45–52. https://doi.org/10.1016/S0378-4274(02)00483-6. David, Muniswamy, Shambanagouda R. Marigoudar, Vineetkumar K. Patil, e Ramesh Halappa. 2012. “B v or l morp olo l orm t s n om rk rs o ox t v m s n tors of sublethal cypermethrin intoxication on th t pol s o D. m l nost tus (S n r 1799)”. Pesticide Biochemistry and Physiology 103 (2): 127–34. https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2012.04.009. D v son C rlos H. Br l y S r M rk R. J nn n s. 2001. “D l n s o t C l orn Red-Legged Frog: Climate, UV-B H t t n P st s Hypot s s”. Ecological Applications 11 (2): 464–79. https://doi.org/10.2307/3060902. Diniz-Filho, José Alexandre Felizola, Luis Mauricio Bini, Míriam Plaza Pinto, Thiago Fernando L. V. B. Rangel, Priscilla Carvalho, Sibelius Lellis Vieira, e Rogério Pereira Bastos. 2007. “Cons rv t on B o o r p y o Anur ns n Br z l n C rr o”. Biodiversity and Conservation 16 (4): 997–1008. https://doi.org/10.1007/s10531-006-9010-4. “Doss ê ABRASCO: Um Al rt So r os Imp tos dos Agrotóxicos na Saúde - ABRASCO”. [s.d.]. Acessado 7 de fevereiro de 2018.

52

https://www.abrasco.org.br/site/noticias/institucional/dossie-abrasco-um-alerta-sobre-osimpactos-dos-agrotoxicos-na-saude/9898/. Da Silva J.; Moraes C. R.; Heuser V. D.; Andrade V. M. et al. Evaluation of genetic damage in a Brazilian population occupationally exposed to pesticides and its correlation with polymorphisms in metabolizing genes. Mutagenesis v. 23 n. 5 p. 415-422. 2008. De Lima F; Delben D.M. Reforma neomalthusiana e movimento ambientalista: população e meio ambiente. Revista geonorte v. 4 n. 2 p. 575-589. ISSN 2237-1419. 2015. Denis, M. H.; Delrot, S. Carrier-mediate uptake of glyphosate in broad bean (Vicia faba) via a phosphate transporter. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 87, p. 569-575, 2015. Domingues Júnior, A.P. Avaliação dos efeitos do herbicida glifosato sobre o cafeeiro: respostas bioquímicas e fisiológicas. 2011.73 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Unicamp, Campinas, 2011. Duellman, W. E.; Trueb, L. Biology of amphibians. Baltimore: The Johns Hopkins University Press, 1994. Edwards, W. M., G. B. Jr. Triplett, And R. M. Kramer. A watershed study of glyphosate transport in runoff. Journal of Environmental Quality 9 (4): 661 – 665. 1980. Edginton, A. N., P. M. Sheridan, G, R. Stephenson, D. G. Thopson, And H. J. Boermans. Comparative effects of pH and Vision Herbicide on two life stages of four anuran amphibian species. Environmental Toxicology and Chemistry 23 (4): 815 – 822. 2004. Escalante A. (1983). Contribución al conocimiento de las relaciones tróficas de peces de agua dulce del área Platense. III. Otras especies. Limnobios 2:453-463. Fedtke, C.; Duke S.O. Herbicides. In: Hock, B.; Elstner, E.F. Plant Toxicology. New York: Crc Press, 4 ed, 2004, 662p. Ferreira, C.M. Análises complementares obtidas a partir de testes de toxicidade aquática. In: Ranzani-PaivA, M.J.T.; TAKEMOTO, R.M.; LIZAMA, M.A.P. (Eds). Sanidade de organismos aquáticos. São Paulo: Varela, p.273-284, 2004. Figueiredo, J.; Neto, G. G. Aspectos da percepção ambiental de um grupo de empresários de Sinop, Mato Grosso, Brasil. Revista Eletrônica do Mestrado em Educação Ambiental, v. 22, 2009. Figueiredo, Jaime, e Domingos de Jesus Rodrigues. 2014. “E ts o our typ s o p st s on survival, time and size to metamorphosis of two species of tadpoles (Rhinella and Physalaemus ntr l s) rom t sout rn Am zon Br z l”. The Herpetological Journal 24 (1): 7–15. Figueiredo, M.R.A. Interações entre os herbicidas 2,4-D e glifosato: aspectos químicos, bioquímicos e fisiológicos. 2015. 114 f. Dissertação (Mestrado em Ciências. Área de concentração: Fitotecnia) - Es ol Sup r or A r ultur “Lu z Qu roz” Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2015.

53

Freire, Carmen, Rosalina Jorge Koifman, Paula Novaes Sarcinelli, Ana Cristina Simões Rosa, Ruth Clapauch, e Sergio Koifman. 2013. “Lon -term exposure to organochlorine pesticides and thyroid status in adults in a heavily contaminated area in Braz l”. Environmental Research 127 (novembro): 7–15. https://doi.org/10.1016/j.envres.2013.09.001. Flint, J.L.; Barrett, M. Antagonism of Glyphosate Toxicity to Johnsongrass (Sorghum halepense) by 2,4-D and Dicamba. Weed Science, Champaign, v., 37, n. 5, p. 700-705, set. 1989. Frost Darrel R. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 6.0. Disponível em: http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html. American Museum of Natural History New York USA. 2016 acessado em Jan 2016. Gasques, J. G.; Bastos, E. T.; Valdez, C.; Bacchi, M. R. P. Produtividade e crescimento: algumas comparações. In: Alves, E. R. de A.; Souza, G. da S. e; Gomes, E. G. (Ed.). Contribuição da Embrapa para o desenvolvimento da agricultura no Brasil. Brasília, DF: Embrapa, 2013. p. 155140. G sy Jo n P. Stu rt Do son K t R. Solomon. 2000. “E otox olo l R sk Ass ssm nt ® for Roundup ^® H r ”. In Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 35–120. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4612-1156-3_2. Gr n J rom M. 1989. “H r Ant on sm t t W ol Pl nt L v l”. Weed Technology 3 (2): 217–26. https://doi.org/10.1017/S0890037X00031717. Grisolia, Cesar K., Carla L. G. Rivero, Fernando L. R. M. Starling, Izabel C. R. da Silva, Antonio C. Barbosa, Jose G. Dorea, Cesar K. Grisolia, et al. 2009. “Pro l o m ronu l us frequencies and DNA damage in different species of fish in a eutrophic trop l l k ”. Genetics and Molecular Biology 32 (1): 138–43. https://doi.org/10.1590/S1415-47572009005000009. Grossm nn Kl us. 2010. “Aux n H r s: Curr nt St tus o M n sm n A t on”. Pest Management Science 66 (2): 113–20. https://doi.org/10.1002/ps.1860.

Mo

o

Hartmann, A., E. Agurell, C. Beevers, S. Brendler-Schwaab, B. Burlinson, P. Clay, A. Collins, et l. 2003. “R omm n t ons or Con u t n t n V vo Alk l n Com t Ass y”. Mutagenesis 18 (1): 45–51. https://doi.org/10.1093/mutage/18.1.45. Hayes, T. B.; Falso, P.; Gallipeau, S.; Stice, M. The cause of global declines: a developmental n o r onolo st‟s p rsp t v . J Exp Biol., v. 213, n. 6, p. 921–933, 2010. Hayes, J. D.; Strange, R. C. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences. Pharmacology, v. 61, n. 3, p. 154-166. 2000. Herzfeld, D.; Sargent, K. Private pesticide applicator safety education manual. 19 ed. University of Minnesota, Extension. 2011. Hoshi L. Genotoxicidade em floricultores da região serrana do Rio de Janeiro: uso do teste de micronúcleo na mucosa oral; Genotoxicity in flower growers in the mountainous region of Rio de Janeiro: use of micronucleus test in oral mucosa. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, FIOCRUZ, Rio de Janeiro. 2009. 54

Hortellani M. A. et al. Avaliação da contaminação por elementos metálicos dos sedimentos do Estuário Santos-São Vicente. Química Nova v. 31 n. 1 p. 10, 2008. ISSN 0100-4042. 2012. Iucn. 2014. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.2. Accessible at .Downloaded on 20 February. 2016. Jones, D. K., J. I. Hammond, And R. A. Relyea. Competitive stress can make the herbicide Roundup® more deadly to larval amphibians. Environmental Toxicology and Chemistry 30 (2): 446 – 454. 2011. Jon s D v n K. Jo n I. H mmon R k A. R ly . 2010. “Roun up® and Amphibians: The Import n o Con ntr t on Appl t on T m n Str t t on”. Environmental Toxicology and Chemistry 29 (9): 2016–25. ttps:// o .or /10.1002/ t .240. 2011. “Comp t t v Str ss C n Make the Herbicide Roundup® Mor D ly to L rv l Amp ns”. Environmental Toxicology and Chemistry 30 (2): 446–54. https://doi.org/10.1002/etc.384. Jones, D. K., J. I. Hammond, And R. A. Relyea. Competitive stress can make the herbicide Roundup® more deadly to larval amphibians. Environmental Toxicology and Chemistry 30 (2): 446 – 454. 2011. Junior, O.P.A.; Santos, T.C.R.; Nunes, G.S.; Ribeiro, M.L. Breve revisão de métodos de determinação de resíduos do herbicida ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D). Química Nova. v. 26, n. 2, p. 223-229, 2003. Lajmanovich, R. C., A. M. Attademo, P. M. Peltzer, C. M. Junges, And M. Cabagna. Toxicity of four herbicide formulations with glyphosate on Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae) tadpoles: B-esterases and glutathione S-transferase inhibitors. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 60: 681– 689. 2011. Lajmanovich, R. C., M. T. Sandoval, e P. M. Peltzer. 2003. “In u t on o Mort l ty n M l orm t on n S n x N s us T pol s Expos to Glyp os t Formul t ons”. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 70 (3): 612–18. https://doi.org/10.1007/s00128003-0029-x. Lajmanovich, R. C., C. M. Junges, A. M. Attademo, P. M. Peltzer, M. C. Cabagna-Zenklusen, and A. Basso. Individual and Mixture Toxicity of Commercial Formulations Containing Glyphosate, Metsulfuron-Methyl, Bispyribac-Sodium, and Picloram on Rhinella arenarum Tadpoles. Water, Air and Soil Pollution 224: 1 – 13. 2013. Larini, L. Toxicologia. São Paulo: Editora Manole, 2ª Edição; 281p. 1993. Londres F. Pesticidas no Brasil: um guia para ação em defesa da vida. ISSN 8587116150. 2011. Luz, N. B.; Santos, H. P.; Melo, G.W. Avaliação da Resposta Espectral de Folhas de Aveia Preta (Avena Strigosa) Cultivadas em Diferentes Solos da Serra Gaúcha, com Adição de Cobre e Matéria Orgânica. In: ANAIS DO SBSR, 11, 2003, Belo Horizontes. Resumos. Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais. p. 2343-2349. 2003.

55

Lucinda Phf (2003) Family Poeciliidae. In: Reis RE, Kullander SO e Ferraris Jr CJ (eds) Check list of the freshwater fishes of South and Central America. EdiPUCRS, Porto Alegre, pp 555581. Lu n P ulo H. F. 2005. “Syst m t s o t nus Cn st ro on G rm n 1895 (Cypr no ont orm s: Po l : Po l n )”. Neotropical Ichthyology 3 (2): 259–70. https://doi.org/10.1590/S1679-62252005000200003. Lucinda, Paulo Henrique Franco, e Roberto E. Reis. 2005. “Syst m t s o t su m ly Poeciliinae Bonaparte (Cyprinodontiformes: Poeciliidae), with an emphasis on the tribe Cn st ro ont n Hu s”. Neotropical Ichthyology 3 (1): 1–60. https://doi.org/10.1590/S167962252005000100001. Kirby, C. The Hormone Weedkillers: A Short History of Their Discovery and Development. London Road, Croydon, UK: British Crop Protection Council. 55 p. 1980. Kumaravel, T. S., e Awadhesh N. Jha. 2006. “R l l Com t ss y m sur m nts or t t n DNA m n u y on s n r t on n m ls”. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 605 (1): 7–16. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2006.03.002. Martin, R.A.; Edgingtona, L.V. Comparative systemic translocation of several xenobiotics and sucrose. Pesticide Biochemistry and Physiology, San Diego, v. 16, p. 87–96, 1981. M nn R. M. J. R. B w ll. 1999. “T Tox ty o Glyp os t n S v r l Glyp os t Formul t ons to Four Sp s o Sout w st rn Austr l n Fro s”. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 36 (2): 193–99. Meyer, A e Lydeard, C (1993) The evolution of copulatory organs, internal fertilization, placentae and viviparity in killifishes (Cyprinodontiformes) inferred from a DNA phylogeny of the tyrosine kinase gene X-src. Proc R Soc Lond B Biol Sci 254:153-162. Mithila, J., J. Christopher Hall, William G. Johnson, Kevin B. Kelley, e Dean E. Riechers. 2011. “Evolut on o R s st n to Auxinic Herbicides: Historical Perspectives, Mechanisms of R s st n n Impl t ons or Bro l W M n m nt n A ronom Crops”. Weed Science 59 (4): 445–57. https://doi.org/10.1614/WS-D-11-00062.1. Moreira, D.; Queiroz, A.C. Inovação: conceitos fundamentais. In: MOREIRA, D.; QUEIROZ, A.C. Inovação tecnológica e organizacional. São Paulo: Thomson Learning, 2007. Moore, D. R. Church, J. E. Mckay, And J. R. Mendelson Iii (Eds). Amphibian conservation action plan. Proceedings: IUCN/SSC Amphibian Conservation Summit. The World Conservation Union (IUCN), Gland, Switzer-land, p. 32–35. 2005. Monsanto Do Brasil Ltda. Fispq - Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos. Roundup® Transorb R. 2013. Mcdiarmid, R.W; ALTIG, R. Tadpoles: The Biology of Anuran Larvae. Chicago and London: The University of Chicago Press, 1999.

56

Nalewaja, J.D.; Matysiak, R. 2,4-D and Salts Combinations Affect Glyphosate Phytotoxicity. Weed Technology, v.6, n. 2, p. 322-327, abr/jun. 1992. Nice, G.; Johnson, B.; BAUMAN, T. Amine or Ester, which is better? Purdue Extension Weed Science. 2004. Disponível em: . Acesso em: 08 out. 2015. Ol v P. L. J. P. B n t R. E. Dur n . 1990. “H t ro n ty n R tion-Induced DNA D m n R p r n Tumor n Norm l C lls M sur Us n t „Com t‟ Ass y”. Radiation Research 122 (1): 86–94. P r nt Lynn R. 1981. “A P ylo n t n Bo o r p An lys s o Cypr no ont orm Fishes (Teleostei, Atherinomorpha). Bull t n o t AMNH ; v. 168 Art l 4”. http://digitallibrary.amnh.org/handle/2246/438. Peres F., Moreira J. C. Saúde e ambiente em sua relação com o consumo de agrotóxicos em um pólo agrícola do Estado do Rio de Janeiro Brasil Health environment and pesticide use in a farming area in Rio de Janeiro State Brazil. Cad. Saúde Pública v. 23 n. Sup 4 p. S612-S621. 2007. Petronilho E. D. C.; Pinto A. C.; Figueroa-Villar J. D. Acetilcolinesterase: Alzheimer e guerra química. Revista Militar de Ciência e Tecnologia v. 28 n. 1. 2011. Pignati, W.A. And J. M. H. Machado. O agronegócio e seus impactos na saúde dos trabalhadores e da população do estado de Mato Grosso. Rio de Janeiro: Fiocruz/Ens. Pp 81-105. 2007. Querino De Araújo Caldas L. Intoxicações exógenas agudas por carbamatos organofosforados compostos bipiridílicos e piretróides. In: (Ed.). Intoxicações exógenas agudas por carbamatos organofosforados compostos bipiridílicos e piretróides: CCIN 2000. Rashed, M. N. Monitoring of environmental heavy metals in fish from Nasser Lake. Environment International, v. 27, n. 1, p. 27–33, jul 2001. Reznick D, Hrbek T, Caura S, Greef, J e Roff, D (2007) Life history of Xenodexia ctenolepis: implications for life history evolution in the family Poeciliidae. Biol J Linn Soc Lond 92:77-85. R ly R. A. 2005. “T L t l Imp ts o Roun up® and Predatory Stress on Six Species of Nort Am r n T pol s”. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 48 (3): 351–57. https://doi.org/10.1007/s00244-004-0086-0. R ly R k A. 2006. “T E ts o P st s PH n Pr tory Str ss on Amp ns under M so osm Con t ons”. Ecotoxicology (London, England) 15 (6): 503–11. ® https://doi.org/10.1007/s10646-006-0086-0. 2012. “N w E ts o Roun up on Amphibians: Predators Reduce Herbicide Mortality; H r s In u Ant pr tor Morp olo y”. Ecological Applications: A Publication of the Ecological Society of America 22 (2): 634–47. R ly R k J son Hov rm n. 2006. “Ass ss n t E olo y n E otox olo y: A R v w n Synthesis in Freshwater Syst ms”. Ecology Letters 9 (10): 1157–71. https://doi.org/10.1111/j.1461-0248.2006.00966.x. 57

Ribeiro M. L.; Lourencetti C.; Polese L.; Navickiene S. et al. Pesticidas: Usos e Riscos para o Meio Ambiente. Holos Environment v. 8 n. 1 p. 53-71. 2009. Ribeiro J. W.; Bertoluci J. Anurans of the cerrado of the Estação Ecológica and the Floresta Estadual de Assis southeastern Brazil. Biota Neotropica v. 9 n. 1 p. 0-0. ISSN 1676-0603. 2009. R n u l t R.A; Ar m uru R.H. & D Ar m uru A.A. (1967). “Los p s argentinos de agua ul ”. Com s ón Inv st on s C nt s l Prov n Bu nos A r s L Pl t 602 pp. Rossa-Feres, Denise de Cerqueira, e Fausto Nomura. 2006. “C r t r z t on n t xonom k y for tadpoles (Amphibia: Anura) from the nort w st rn r on o S o P ulo St t Br z l”. Biota Neotropica 6 (1): 0–0. https://doi.org/10.1590/S1676-06032006000100014. Rossa-Feres, D. de C. et al. Anfíbios do estado de São Paulo, Brasil: conhecimento atual e perspectivas. Biota Neotropica, v. 11, n. 1, p. 1-19. 2011. Rodrigues, B.N.; Almeida, F.S. Guia de herbicidas. 6a edição. Londrina: Edição dos autores, 2011. 697 p. Roman et al. Como funcionam os herbicidas: da biologia à aplicação. Passo Fundo: Gráfica Editora Berthier, 2007. 158 p. Sarikaya, Rabia, e Mehmet Yilmaz. 2003. “Inv st t on o A ut Tox ty n t E t o 2 4D (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid) Herbicide on the Behavior of the Common Carp (Cyprinus Carpio L., 1758; Pis s Cypr n )”. Chemosphere 52 (1): 195–201. https://doi.org/10.1016/S0045-6535(03)00106-1. Silva, Juliana da, Camila R. Moraes, Vanina D. Heuser, Vanessa M. Andrade, Fernanda R. Silva, Kátia Kvitko, Vanessa Emmel, et al. 2008. “Ev lu t on o G n t D mage in a Brazilian Population Occupationally Exposed to Pesticides and Its Correlation with Polymorphisms in M t ol z n G n s”. Mutagenesis 23 (5): 415–22. https://doi.org/10.1093/mutage/gen031. Simioni, Fernanda, Débora Fabiane Nevis da Silva, e Tami Mott. 2013. “Tox ty o Glyp os t on P ys l mus Al onot tus (St n n r 1864) rom W st rn Br z l”. Ecotoxicology and Environmental Contamination 8 (1): 55–58. Sn N. P. M. T. M Coy R. R. T Quant t t on o Low L v ls o DNA D m 175 (1): 184–91.

E. L. S n r. 1988. “A S mpl T n qu or n In v u l C lls”. Experimental Cell Research

Santos et al. Eficiência do 2,4-D aplicado isoladamente e em mistura com glyphosate no controle da trapoeraba. Planta Daninha, Viçosa, v.20, n.2, p. 299-309, 2002. Santos M.A.T.D.; Areas M. A.; Reyes F. G. R. Piretróides–uma visão geral. Alimentos e Nutrição Araraquara v. 18 n. 3 p. 339-349. ISSN 2179-4448. 2008. Sá L.C. et al. Determination of organochlorine pesticides in agricultural soils applying Quechers C-ECD and GC-MS/MS. Revista de Ciências Agrárias (Portugal): Sociedade de Ciências Agrárias de Portugal 329-336 p. 2012.

58

Seixas Filhos, J.T. et al. Efeito de diferentes salinidades da água sobre o desempenho de girinos de Rana catesbeiana (Shaw, 1802). Augustus, v. 8, n. 16, p. 14-23. 2003. Silva Filho, P. B. Efeitos do Roundup® e do Thiodan® em adultos de Astyanax bimaculatus (Characidae: Teleostei): Valores de CL50 e morfologia testicular. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) - Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais. 2013. Scasso F, N. Mazzeo, J. Gorga, C. Kruk, G. Lacerot, J. Clemente, D. Fabián & S. Bonilla (2001). Limnological changes of a subtropical shallow hypertrophic lake during its restoration. Two years of whole-lake experiment. Aquatic Conservation: Marine Freshwater Ecosystems 11: 3144. Schiesari, L., A. Waichman, T. Brock, C. Adams, And B. Grillitsch. Pesticide use and biodiversity conservation in the Amazonian agriculture frontier. Philosophical Transactions of the Royal Society B 368: 1 – 9. 2013. S s r Lu s Br tt Gr ll ts H nz Gr ll ts . 2007. “B o o r p B s s nR s r n T r Cons qu n s or L nk n Amp n D l n s to Pollut on”. Conservation Biology: The Journal of the Society for Conservation Biology 21 (2): 465–71. https://doi.org/10.1111/j.1523-1739.2006.00616.x. Schiesari, Luis, Andrea Waichman, Theo Brock, Cristina Adams, e Britta Grillitsch. 2013. “P st Us n B o v rs ty Cons rv t on n t Am zon n A r ultur l Front r”. Phil. Trans. R. Soc. B 368 (1619): 20120378. https://doi.org/10.1098/rstb.2012.0378. Solomon, K. R., And D. G. Thompson. Ecological risk assessment for aquatic organisms from over-water uses of glyphosate. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B: Critical Reviews 6 (3): 289 – 324. 2003. Souza Jp. Toxicidade Aguda e Risco Ambiental do Diflubenzuron para Daphia magna, Poecilia reticulata e Lemna minor na Ausência e Presença de Sedimento. Dissertação Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura; Jaboticabal, São Paulo. 2008. Suwalsky, M.; Benites, M.; Villena, F.; Aguilar, F.; Sotomayor, C.P. Interaction of 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) with cell and model membranes. Biochimica et Biophysica Acta. v. 1285, p. 267-276, 1996. Spadotto Ca. Abordagem Interdiciplinar na Avaliação Ambiental de Agrotóxicos. 2002. Stuart, S.N., Chanson, J.S., Cox, N.A., Young, B.E., Rodrigues, A.S.L., Fischman, D.L.,Waller, R.W. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science 306, 1783–6. doi:10.1126/science.1103538. 2004. Sterling, T.M.; Hall, J.C. Mechanism of action of natural auxins and the auxinic herbicides. In: ROE, R.M.; BURTON J. D.; KUHR, R. J. Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology. Amsterdam, the Netherlands: IOS Press, p. 111–141, 1997. 2,4-D: FACT SHEET. Disponível em: www.gn.apc.org/pesticidestrust/aifacts/24d.htm. Acesso em: 19 junho. 2017.

59

Takano, H.K. et al. Efeito da adição do 2,4-D ao glyphosate para o controle de espécies de plantas daninhas de difícil controle. Revista Brasileira de Herbicidas, v.12, n.1, p.1- 13, jan./abr. 2013. T x r D M llo F. (2007). “E to l uso l su lo sobre la calidad del agua y las omun s p s n s st m s lót os l u n j l R o S nt Lu (Uru u y)”. Tesis de Maestría en Ciencias Ambientales. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 58 pp. Toledo L. F.; Neumann-Leitão S.; El-Dier S. Anfíbios como bioindicadores. Bioindicadores da qualidade ambiental (S. Neumann-Leitão & S. El-Dier org.). Instituto Brasileiro Pró-Cidadania Recife p. 196-208. 2009. Toni Luís R. M.; SANTANA Henrique De; ZAIA Dimas A. M.. Adsorção de glifosato sobre solos e minerais. Quím. Nova São Paulo v. 29 n. 4p. 829-833 July. 2006. Tu, M.; Callie, H.; Randall J.M. The Herbicides: Herbicide Table A) 2,4-D. In: Tu,M.; Callie, H.; Randall J.M. Weed Control Methods Handbook: Tools & Techniques for Use in Natural Areas. The Nature Conservancy, 2001, p.7a10. Disponível em: . Acesso em: 10 Out. 2015. Thompson, D. G., B. F. Wojtaszek, B. Staznik, D. T. Chartrand, And G. R. Stephenson. Chemical and biomonitoring to assess potential acute effects of Vision Herbicide on native amphibian larvae in forest wetlands. Environmental Toxicology and Chemistry 23 (4): 843 – 849. 2004. Thompson, D. G., B. F. Wojtaszek, B. Staznik, D. T. Chartrand, And G. R. Stephenson. Chemical and biomonitoring to assess potential acute effects of Vision Herbicide on native amphibian larvae in forest wetlands. Environmental Toxicology and Chemistry 23 (4): 843 – 849. 2004. Trezzi M. M. Vidal Ra; Merotto Jr. A. Herbicidas inibidores da ALS. Herbicidologia. Porto Alegre: Edição dos Autores p. 152. 2001. United States Environmental Protection Agency (Usepa). 2,4-D (2,4- Diclhorophenoxyacetic acid). 2003. Disponível em http://www.epa.gov/ (Acessado em 27/05/06). Usepa. United States Environmental Protection Agency. Toxicity assessment. Chapter 7. Disponível em: . Acesso em: 5 mai. 2016. United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Service. USDANASS. 2008. Agricultural Chemical Use Database. Washington, DC: USDA-NASS. Disponível em: Accesso em 29 set 2016. Vanneste S.; Friml J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell, v. 136, p. 1005– 1016, 2009.

60

Van Der Oost, R.; Beyer, J.; Vermeulen, N.P.E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 13, n. 2, p. 57–149, fev 2003. Veiga M.M. et al. Análise da contaminação dos sistemas hídricos por pesticidas numa pequena comunidade rural do Sudeste do Brasil. Cadernos de Saúde Pública v. 22 p. 2391-2399. 2006. Vitt, L.J., Caldwell, J.P., Wilbur, H.M., Smith, D.C. Amphibians as harbingers of decay. Bioscience 40, 418–418. doi:10.1093/bioscience/40.6.418. 1990. Yamashita M.G.N. Análise de rótulos e bulas de pesticidas segundo dados exigidos pela legislação federal de pesticidas e afins e de acordo com parâmetros de legibilidade tipográfica. Aguiar Tja e Monteiro Msl. Modelo agrícola e desenvolvimento sustentável: a ocupação do cerrado piauiense. Ambiente e Sociedade. 2005;8(2):1-18. 2008. Younes, M.; Galal-Gorchev, H. Food Chemisty. Toxicology. Philadelphia, v.38, p. 587, Dec. 2000. Wang, C.J.; Liu, Z.Q. Foliar uptake of pesticides: presente status and future challenge. Pesticide Biochemistry and Physiology, San Diego, v.87, p.1-8, 2007. Walker, C.H. et al. Principles of ecotoxicology. 3. ed. Boca Raton: Taylor & Francis Group. 2006. Walker, C.H. Alternative approaches and tests in ecotoxicology: a review of the present position n t prosp ts or n t k n nto ount ECVAM‟s ut s, topic selection and test Criteria. ATLA, v. 26, p. 649-677. 1998. Wehtje, G.; Walker, R.H. Interaction of glyphosate and 2,4-DB for the controle of selected morningglory (Ipomoea spp.) species. Weed Technology, v. 11, p. 152-156, 1997. Weygoldt, P. Changes in the composition of mountain stream frog communities in the Atlantic mountains of Brazil: Frogs as indicators of environmental deteriorations? Stud. Neotrop. Fauna Environ. 24, 249–255. doi:10.1080/01650528909360795. 1989. World Health Organization. Guidelines for drinking-water quality. 2.ed. v.2. Health criteria and other supporting information. Geneva: WHO, 1998. Woehl Jr.; G.; Woehl, E. N. Cartilha: Anfíbios da Mata Atlântica. Jaraguá do Sul: Instituto RãBugio para Conservação da Biodiversidade. 2008.

61

CAPÍTULO II Evaluation of genotoxic and mutagenic effects of glyphosate Roundup Original® in Dendropsophus minutus Peters, 1872 tadpoles Carvalho, WF1,6; Franco, FC2,6; Godoy, FR3,6; Costa, RN5; Sotero, DF6; Avelar, JB2 Pereira, RR2; Nomura, F4; da Cruz, AD7; Saboia-Morais, SM8; Silva, DM1,2,6 1

Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,

Goiás, Brasil. 2

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás,

Goiânia, Goiás, Brasil. 3

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, Universidade Federal de

Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 4

Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Evolução, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 5

Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais - Universidade

Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil. 6

Laboratório de Mutagênese e Radiobiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade

Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 7

Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia, Mestrado em Genética, Pontifícia

Universidade Católica de Goiás, Brasil. 8

Laboratório de Comportamento Celular, Departamento de Morfologia, Mestrado em

Biodiversidade Animal, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil.

62

ABSTRACT Glyphosate is an herbicide widely used in Brazilian crops and commonly found in water bodies. Despite the benefits of pest control and increasing agricultural production, improper use of these environmental contaminants may accelerate the decline of species, especially frogs. The aim of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effects of glyphosate (Roundup Original®) in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872)by comet assay and micronucleus test. Fourteen egg masses were collected in two distinct permanent ponds situated in Chapada dos Veadeiros National Park in Alto Paraíso de Goiás, Brazil. The acute exposure was conducted with 180 tadpoles, kept for 90 days in a storage tank until development stage 2631. During the acclimation, tadpoles were distributed into 36 tanks and were exposed to four concentrations, as follows: T1 = 0.28 mg ai / L; T2 = 1.0 mg ai / L; T3 = 2.0 mg ai / L, T4 = 4.0 mg ai / L of glyphosate (Roundup Original®), a negative control = 0 mg ai./L, and a positive control = 10 mg ai / L mitomycin C. After 96 hours of exposure, the tadpoles were euthanized with lidocaine 5% and were submitted to comet assay and micronucleus test. In the comet assay, a significant increase in DNA damage was observed in the concentration of 0.28 mg ai / L for tail length, % DNA in the tail, and Olive tail moment. There was no dose-response effect at other concentrations. For the micronucleus test, we did not find a statistically significant increase in micronuclei in erythrocytes of Dendropsophus minutus (Peters, 1872)after 96 hours of exposure to glyphosate. Therefore, in the present study it was observed that tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) are extremely sensitive to lower concentrations of glyphosate, monstr t n

t

mport n

o

mp

ns‟ t pol s

n stu

s o

notox

ty

n

mutagenicity.

Keywords: Comet assay; Environmental; Micronucleus test; Mutagenesis.

63

1.

INTRODUCTION Due the advancement of agricultural frontiers, areas of high biodiversity are being

converted into agricultural lands (Schiesari and Grillitsch, 2011; Schiesari et al., 2012). Agropastoral activities and the application of nonselective agrochemicals in neotropical regions, especially in Brazil, are among the main causes of habitat loss and contamination on a large scale, directly contributing to the decline of native species of Brazilian biomes (Sparling and Bishop, 2002; Schiesari and Grillitsch, 2011; Schiesari et al., 2012). According to some authors (Stuart, 2004; Pimenta, 2005) human interference, generating pollution, greenhouse effect, decrease in the ozone layer, among others, are likely to adversely affect many species of organisms, including amphibians. Pounds et al. (2006), for example, showed evidence that many amphibian extinctions in the mountainous environments of Costa Rica resulted from the outbreak of a pathogen, boosted by global warming. In addition to these factors, other studies have shown a direct relationship between the decline of populations and proximity to agricultural areas (Bishop et al., 1999; Davidson et al., 2001; Sparling and Bishop, 2002). Pesticides and herbicides have received great attention for the benefits of controlling pests and increasing agricultural production; however, they have the potential to accelerate the decline of species, making it necessary to assess their impact on non-target organisms (Relyea, 2005, 2011). Glyphosate (marketed by Monsanto as Roundup®) is an example of a non-selective herbicide, highly effective against weeds and used on most crops in Brazil (De Amarante Junior et al., 2002). The formulation for Roundup® includes polioxietileno amina surfactant (polyethoxylated tallow amine, or POEA), a substance used to increase the effectiveness of the herbicide and facilitate penetration of the active ingredient into leaf tissue. Due to this composition, Roundup® has an acute toxicity greater than pure glyphosate, causing in turn a high mortality in fish and amphibians (Giesy et al., 2000). The herbicide is intended for inland use and tends to be inactive when absorbed by the soil; however, this interaction is not fully understood (De Amarante Junior et al., 2002). It is known that the application of chemicals near large water bodies is prohibited; however, there are no parameters that relate to protection of small wetlands and temporary ponds, where many species breed and which can be contaminated during aerial application (Thompson, 2004). Depending on environmental conditions, the active ingredient (glyphosate) and surfactant (polioxietil amina) can remain active in the water during an interval of 7 to 70 days (Giesy et al., 64

2000). Despite its earthly destination, there are several reports that confirm the presence of Roundup® n w t r o

s v

“spr y”

r l ppl

t on

rsn

n l

n w t r or runo

(Goldsborough and Beck, 1989; Feng and Thompson, 1990; Thompson, 2004; Queiroz et al., 2011). In this context, amphibians have behavioral and specific physiological characteristics, such as: permeable skin, little mobility, complex life cycles, with simultaneous dependence on aquatic and terrestrial environments, wide range of reproductive modes, and differences in diet between tadpoles and adults, that make them extremely sensitive to environmental variations (Blaustein and Wake, 1990; Vitt et al., 1990; Alford and Richards, 1999; Beebee and Griffiths, 2005). The loss and mischaracterization of environments, pollution of water and air, and adverse weather conditions are the causes of the reduction in amphibian populations, with consequent local and global extinctions of species. The conservation status of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) s o “l st on rn” because it is very abundant and has broad geographical distribution (Silvano et al., 2010). Many analyses based on water quality are dedicated to measuring in situ, reflecting the momentary chemical and physical conditions of a water body, discarding the time factor and its inserted organisms (Queiroz et al., 2011). Therefore, the search for biomonitoring tools is intense (Sanseveriano and Nessimian, 2008). In Brazil, there are few studies that evaluate the effects of glyphosate on frog tadpoles (Simioni et al., 2013; Figueiredo and Rodrigues, 2014), and most studies are related to North American species (Edginton et al., 2004; Thompson, 2004; Relyea, 2005a, 2005b, 2011; Relyea et al. 2009, 2011). In Brazil, toxicity tests are required by IBAMA and seek the protection of Brazilian fauna. However, environmental protection agencies clearly give most of their attention to testing adults, so the legislation does not address the different requirements of and threats to the larval stage. Thus, it is understood that the guidelines and standards established for the protection of water bodies (Conama, 2005) do not fit and are not in accordance with the ecological needs of tadpoles, making more specific tests necessary. Several chemicals have binding affinity with the genetic material of living organisms, may cause alterations and/or DNA damage, and are therefore called genotoxic agents (de Boer and Hoeijmakers, 2000). Genotoxic effects could affect the genome, promoting DNA breakage, and can result in the loss of genetic material, sister chromatid exchanges, and, if the lesion is not repaired, mutations that can trigger carcinogenic processes (Dearfield et al., 2002).

65

Finally, genotoxicity and mutagenicity involving amphibians are essentially important for the detection of indicator species of environmental change (Weygoldt, 1989; Blaustein and Wake, 1990; Vitt et al., 1990; Dalton, 2000), and their sensitivity may explain population declines that occur without any noticeable habitat changes (Stuart, 2004). In this context, the aim of our study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effects of glyphosate formulation (Roundup Original®) in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) (Anura: Hylidae). 2.

MATERIAL AND METHODS

2.1.

Chemical compost We used the commercial formulation Roundup Original® herbicide, containing 48%

glyphosate (N - phosphonomethyl - glycine) and 52% POEA (Monsanto Company, St. Louis, MO, USA) for all the experiments.

2.2.

Test organism sampling We collected 14 bodies of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) eggs in January 2014.

The sample collection took place over three days in two permanent lentic ponds (pond 1: Four m ss s 14°08'31.27” S 47°38'55.48''O; pon 2: T n p st

m ss s - 14°07'50.08"S,

47°41'53.29''O) surrounding Chapada dos Veadeiros National Park in the city of Alto Paraíso de Goiás, Goiás state, Brazil. There were no agricultural activities and all sample sites were under low anthropogenic influence. The egg masses were transported in sacks with native water to Mutagenesis Laboratory of the Universidade Federal de Goiás and were placed in a glass tank (60cm x 40cm x 40cm) with 8L of chlorine water, until the tadpoles hatched. After hatching, the tadpoles were randomized in the glass tank.

2.3.

Acute toxicity biossay We monitored the physicochemical conditions of the water daily (temperature: 21.98 ±

0.13; pH: 7.36 ± 0.13, conductivity: 0.06 ± 0.002 and dissolved oxygen concentration: 7.64 ± 1 , 05). T

r t mp r tur w s 28 ± 2 ° C n t

t nk

p otop r o o 12 ours‟ l

t / 12

hours dark. The tadpoles were kept in the storage tank until they reached the development stage 26-31 (sensu Gosner, 1960). The average size (tip of the nose to tail) was 24.74 ± 1.61 mm and

66

weight was 0.20 ± 0.03 g on average. The animals were fed ad libitum once a day with ornamental fish food. The glyphosate concentrations used in this study were based on CONAMA resolution 357 (Conama, 2005), which allows an average concentration of 280 mg / L (0.28 mg ai./L) in freshwater type III in Brazil. The concentration of glyphosate was uniformly increased based on recent toxicity studies on tadpoles (Jones et al., 2011; Figueiredo and Rodrigues, 2014; Simioni et al., 2013; Costa and Nomura, 2016) and a study to define CL50 and evaluation mortality, where in Dendropsophus minutus (Peters, 1872) LC50 was 2.49 mg ai./L. (R.N.Costa, pers.comm.). Concentrations were negative control = 0 mg ai./L; positive control = 10 mg ai / L mitomycin C; T1 = 0.28 mg ai / L; T2 = 1.0 mg ai / L; T3 = 2.0 mg ai / L, T4 = 4.0 mg ai / L. After that, it performed acute exposure to glyphosate-Roundup Original® for 96h. Each treatment was replicated six times, and in each there were 60 tadpoles (10 animals per tank glass), totaling 360 tadpoles. After 96 hours of exposure, five tadpoles from each treatment were randomly selected for genotoxic and mutagenic analysis; later, five tadpoles were randomly selected for molecular analysis. The Dendropsophus minutus (Peters, 1872) tadpoles were anesthetized for approximately two minutes in a solution of 5% benzocaine. Blood samples were obtained by cross-section from the tadpole tail base, then individuals were deposited in the Herpetologica Collection of the Federal University of Goiás (ZUFG 1509: tadpoles acute exposure / ZUFG 1756 and ZUFG 1757).

2.4.

Comet assay or alkaline single-cell gel electrophoresis The comet assay was performed using the alkaline method as described by (Singh et

al.,1988) with some modifications. The slides were precoated with agarose with a normal melting point (1.5%). Then the plates were prepared with 15 ul of diluted cell suspension in 120 ul of low-melting-point agarose (0.5%) at 37° C. The slides were immersed in lysis solution (Triton X-100 lysis and DMSO stock solution) for 24 hours at a temperature of 6° C and kept protected from light. Electrophoresis was performed at 25 V and the current was set to 300 mA. The slides were routinely exposed to this electric current in the dark for 25 minutes. After electrophoresis, the slides were placed in a staining tray, covered with a neutralization buffer (0.4 M Tris-HCl, pH 7.5), and kept in the dark for 5 minutes.

67

For analysis, the slides were stained with 12 ul of ethidium bromide solution (0.02 mg / mL) and covered with a coverslip. 50 nucleoids per slide were analyzed, totaling 100 nucleoids per sample. The analysis was performed with a Axioplan fluorescence microscope, using Isis software with a 510-560nm excitation filter and a 590nm barrier filter, with a magnification of 200x. The OpenComet plug-in for the popular image processing platform ImageJ was used for evaluation of DNA damage. The ImageJ software (rsbweb.nih.gov/ij/) can display, process, and analyze images and is intended primarily for use with microscopy images (Gyori et al., 2014). Parameters selected for the analysis of comet assay were tail length (TL), percentage of DNA in the tail (% DNA), and Olive moment (OM).

2.5.

Micronucleus test (MN) Two blood smears from each animal were prepared with clean blades. The slides were

fixed in 70% alcohol for 10 minutes. After 12 hours of fixation, they were stained with Giemsa 10%. The slides were coded by a single researcher. The criteria used for the identification of micronuclei were as follows: a smaller diameter than the main diameter of 1/3 nuclei, staining intensity similar to cores, no connection or connection with the cores, and with no overlap between the cores (Fenech, 2000; Ferreira et al., 2004; Cabagna et al., 2006). This study included micronuclei (MN), or segmented binucleate cells (BN), kidney-shaped nuclei (KSN), and total erythrocytic abnormalities (ENA). The frequency of erythrocytic changes was determined by analyzing 1,000 cells per slide using 1,000× magnification, as suggested in the literature (Cabagna et al., 2006).

2.6.

Statistical analysis All tests were performed with the significance level of P ≤ 0.05 n 95% on

n

interval using the STATISTICA 7 software (StatSoft, 2004) and R (R Development Core Team, 2008). All data populations were tested to normality and homocedascity using a KolmogorovSmirnov and Levene tests. After, an ANOVA test was used to determine if there were differences in water temperature, conductivity, dissolved oxygen, and pH between treatments. To estimate DNA damage (TL, % DNA, and OM) and the lesions of the nucleus (MN, SN, and ENA KSN) an analysis of covariance (ANCOVA) was also performed between treatments. The covariates included were temperature, pH, conductivity, oxidation, and total solutes. The contrast

68

of the means was performed using a Tukey test, because this test is less sensitive to type 1 errors (Zar, 2007).

3. 3.1.

RESULTS Acute toxicity bioassay The means of physico-chemical parameters, after 96 hours of exposure to glyphosate-

Roundup Original®, are shown in Table 1. The parameters that showed variation at all concentrations tested, compared to the negative control, were pH (F = 57.8 P = 00:00) temperature (F = 3.65; P = 0.01) and oxygen (F = 9.75; P = 0:00). The biometric variations such as weight (P = 0:43) and size (P = 0.75) of tadpoles did not change between concentrations. There were no death or signs of morbidity in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872), after 96 hours of exposure, in the tested concentrations.

Table 1. Mean and standard deviation of the physicochemical parameters of the concentrations of glyphosate-Roundup Original®. Physical-chemical parameters Treatments Temperature

pH

Conductivity

Oxidation

Total solutes

NC

21.93±0.11

7.13±0.06

0.06±0.00

9.19±0.96

0.04±0.00

T1

21.91±0.11

7.38±0.01

0.06±0.00

7.49±0.29

0.04±0.00

T2

22.05±0.12

7.32±0.04

0.06±0.00

7.505±0.76

0.04±0.00

T3

21.91±0.09

7.46±0.01

0.06±0.00

6.814±0.61

0.04±0.00

T4

22.10±0.08

7.45±0.03

0.06±0.00

7.248±0.35

0.04±0.00

NC: Negative control; T1: 0.28 mg ai / L; T2: 1.0 mg ai / L; T3: 2.0 mg ai / L, T4: 4.0 mg ai / L of glyphosate (Roundup Original®).

3.2.

Comet assay or alkaline single-cell gel electrophoresis Figure 1 demonstrated DNA damage assessed by comet assay. The increase in DNA

damage in tadpoles exposed for 96h was statistically significant at the concentration 0.28 mg ai / L glyphosate-Roundup Original® for all parameters of the comet, TL (F = 3.79; P = 0.01),% DNA in the tail (F = 3.10; P = 0.03). and OM (F = 3.20; P = 0.02), as illustrated in Fig. 2. The physico-chemical parameters (temperature, pH, and oxygen) in which variations between the

69

concentrations were observed did not influence the increase in DNA damage. In other concentrations (T2 = 1 mg ai / L, T3 = 2 mg ai / L, T4 = 4 mg ai / L), there were no statistically significant differences in the comet assay parameters selected for this study.

Figure 1. Images of comet assay detected in tadpoles of Dendropsohus minutus demonstrating in A. No DNA damage; B. Minor DNA damage; C. Increasing DNA damage. D. Major DNA damage.

Figure 2. DNA Damage assessment in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872). A. Tail length, B. Percentage of DNA in the tail; C Olive moment, at concentrations of glyphosateRoundup Original® (T1 = 0.28 mg ai / L, T2 = 1 mg ai / L, T3 = 2 mg ai / L, T4 = 4 mg ai / L and control negative - CN). 70

3.3.

Micronucleus test As for the micronucleus test, after 96 hours of exposure to glyphosate-Roundup

Original® there were no statistically significant differences in the frequency of erythrocytic changes, except for the frequency of binucleated cells (F = 10:35; P = 0.003; z-score = 3.37) due to the increase in temperature as a covariate (Fig. 3). Other physicochemical parameters (pH and oxygen) did not influence the increase in binucleate cells. In Figure 4, we demonstrated a micronucleated and a binucletated cell in the tadpoles of D. minutus.

Figure 3. Analysis of covariance indicating and increase of binucleate cells according to temperature despite the concentration of glyphosate-Roundup Original®.

Figure 4. Micronucleus (A) and Binucleated cells (B) detected in tadpoles of Dendropsohus minutus.

71

4.

DISCUSSION At lower concentratin of glyphosate - Roundup Original®, the DNA damage of

Dendropsophus minutus (Peters, 1872) tadpole showed an increased a time shorter than the micronucleus test exposure and the physicochemical changes did not influence micronucleus frequency or DNA damage, except that the temperature variation caused an increase in the frequency of binucleate cells. It is known that the exposure of organisms to high temperatures can result in changes in the nucleolus integrity and affect the progression of the cell cycle during mitosis. Noland and Ultsch (1981); Hutchison and Dupré (1992) reported that tadpoles are able to regulate their body temperatures with those of the surrounding environment, but the extent and characteristics of the environment in which they live may limit their thermoregulation capacity (Huey and Stevenson, 1979; Wu and Kam, 2005). Tadpoles are considered as a model organism to study thermal tolerances, since they can be found at ambient temperatures of 27ºC to 42ºC (Ultsch et al., 1999; Bury, 2008; Navas et al., 2010 unpublished data). Anitha et al. (2000) found that goldfish exposed to high temperatures can experience delays in the cell cycle, DNA damage, nuclear abnormalities, and chromosomal aberrations in their genetic material, demonstrating the genotoxic and mutagenic effects of thermal shock. Although there are many studies of the thermal biology of frogs in ecological, behavioral, and physiological studies, it is still difficult to assess how climate change affects ectothermic organisms. The loss of amphibian diversity is alarming and can lead to serious consequences for the integrity of the Brazilian and global ecosystems (Navas et al.,2008; Nájera–Hillman et al., 2009; Toledo et al., 2010; de Assis, 2012). A concentration of 0.28 mg ai / L of the commercial formulation Roundup Original ® was enough to cause DNA damage in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872), after 96 hours of exposure. Clements et al. (1997) found that low concentrations (0.70 mg ai / L) of Roundup Original® were not sufficient to induce DNA damage in Rana catesbiana tadpoles. However, exposure to concentrations of 2.7 and 11 mg ai / L resulted in a significant increase in DNA damage in those organisms. In contrast, a study conducted by Relyea (2005) with anuran tadpoles demonstrated that survival was reduced by Roundup Original® at a concentration of 2.0 mg ai / L, though DNA damage was not significantly different from that in the negative controls. Several studies conducted in controlled conditions in the laboratory revealed significant cytotoxic, genotoxic, and mutagenic effects from glyphosate-Roundup Original® in frog tadpoles (Clements et al., 1997; Mann and Bidwell, 1999; Perkins et al., 2000; Lajmanovich et al., 2003; 72

Howe et al., 2004; Relyea, 2005; Bernal et al., 2009; Relyea and Jones, 2009; King and Wagner, 2010; de Basea et al., 2011; Meza-Joya et al., 2013; Yadav et al., 2013). Meza-Joya et al. (2013) observed cytotoxic and genotoxic effects of glyphosate in an adult species of anuran amphibian; however, the tadpole of the same amphibian species was observed to be more sensitive than adults. Alvarez-Moya et al. (2014) used the comet assay to verify the genotoxic potential of glyphosate in human lymphocytes and tilapia. The authors identified greater values for comet tail length for the two species in groups exposed to the herbicide, demonstrating that glyphosate has a genotoxic effect in the analyzed cells, which possibly can be extrapolated to other organisms, especially for those more sensitive to environmental changes, as is the case with amphibians. Rissoli et al. (2016) observed that exposure of bullfrog tadpoles to Roundup Original® cause damage to the epithelium and hypoxia in those animals. Schaumburg et al. (2016) found that exposure to sublethal concentrations of glyphosate during the embryonic stage of a lizard, may cause an increase in genotoxic and mutagenic damage. Some studies of teleost fish have shown that exposure of those organisms to Roundup Original®, ranging from 3 to 15 mg / L-1 for 48h and 96h, caused various changes in the gills, and hypertrophy and hyperplasia of epithelial lamellar (Jiraungkoorskul et al., 2003; Shiogiri et al., 2012; Braz-Mota et al., 2015). Other studies with Infraclass teleostei reported that exposure to Roundup Original® induces chromosome fragmentation and the appearance of micronuclei in diverse cell types, thereby increasing the mutagenic effects (Cavalcante et al., 2008; Rodrigues et al., 2011; López González et al., 2013; Yadav et al., 2013). Therefore, it is assumed that Roundup Original® can cause DNA damage, promoting the fragmentation of chromatin epidermal cells, and affecting cell division. However, no statistically significant differences in micronucleus frequency and DNA damage were identified in other concentrations of glyphosate - Roundup Original®, 1.0 mg ai / L, 2.0 mg ai / L and 4.0 mg ai / L, compared to the negative control, in Dendropsophus minutus (Peters, 1872) tadpoles. Possibly, glyphosate - Original Roundup® has an aneugenic action on the genetic material of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) and, therefore, high DNA damage may have caused the cellular apoptosis, preventing the assessment of genotoxic and mutagenic effects. In addition, concentrations of 1.0 mg ai / L, 2.0 mg ai / L and 4.0 mg ai / L of glyphosate - Roundup Original® were not able to induce MN in the studied species, due to internal physiological and biochemical characteristics not evaluated in this study.

73

Ramírez and Garcia (2005) investigated the mutagenic effects of arsenic in zebra fish gill cells and reported that the frequency of micronuclei increased more than 56 times when compared to the negative control. In a study by Ali et al., (2008), exposure to chlopyrifos concentrations in fishes led to a gradual increase in micronucleus rate, up to 96h of As2O3 exposure, and a gradual decrease after 168h of exposure. These data corroborate a study by Nepomuceno et al., (1997), which reported a time-dependent increase in micronucleus frequencies in common carp followed by a gradual decline during treatment with metallic mercury. For Al-Sabti, (2000) wild carp exposed to a concentration of 10 ppm benzene showed no significant increase in micronucleus rate. It s known t t Br z l s mon t

l r st onsum rs o t

worl ‟s p st

s. In

some states, such as Mato Grosso, the incidence of this consumption is alarming and can be 3.2 times higher than the world average (Schiesari et al., 2013). Contamination of glyphosate in freshwater bodies, including streams, lakes, and wetlands, ranges from 1.4 to 7.6 mg ai / L (Edwards et al., 1980; Mann and Bidwell, 1999; Giesy et al., 2000; Solomon and Thompson, 2003; Thompson, 2004). For this reason, studies like this are needed in order to determine the maximum tolerable levels of contamination of water bodies which will probably not genetically affect fauna and biodiversity in areas of high glyphosate herbicide use. Although the acute toxicity of glyphosate is considered to be low by the World Health Organization (WHO), the effects of commercial formulations of this herbicide on amphibians have been extensively studied in North America (Mann and Bidwell, 1999; Relyea, 2011). This is because the toxicity of this chemical compound is mainly concentrated in polioxietileno amina surfactant (POEA), which is present in its most common commercial formulation of Roundup Original® (Mann and Bidwell, 1999; Perkins et al., 2000; Howe et al., 2004; Cox and Surgan, 2006; Brausch and Smith, 2007). The high-water solubility of Roundup Original® and its harmful effects on aquatic organisms are of great concern in the field of ecotoxicology (Ç v ş and Könen, 2007). Due to the low number of species of Brazilian frogs considered in ecotoxicological studies and the extensive use of herbicides in the country, the impact of glyphosate on biodiversity in frogs is alarming, particularly given their high sensitivity and significant population decline on a global scale in recent times (Relyea, 2003, 2005a, 2005b; Stuart, 2004; Hopkins, 2007; Helander et al., 2012; Vera et al., 2012). Some studies indicate a reduction in survival of some Physalaemus species larvae after exposure to glyphosate (Simioni et al., 2013; Figueiredo and Rodrigues, 2014; Costa and Nomura, 2016). 74

Despite the ecological importance that amphibians play in biodiversity maintenance and trophic balance, and the fact that some species are used as bio-indicators of environmental quality, our findings demonstrate that tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) are sensitive to certain Roundup Original® concentrations, reinforcing the importance of using tadpoles of frogs in studies of genotoxicity and mutagenicity. Due to the informational potential and the relative ease of handling these animals, ecotoxicological testing and evaluation of DNA damage could be applied in environmental monitoring programs to assess the impact of herbicides on the environment. The lack of knowledge of the action of the various surfactants that comprise herbicides, such as POEA, shows the need to isolate and test the effects of these surfactants and their potential to increase the toxicity of commercial formulations of glyphosate on larvae of amphibians and other animals. The high doses of herbicides applied to large areas of cultivation are a real problem in agriculture, putting the biodiversity next to these great regions at risk of exposure. For this reason, it would be wise to alert farmers and chemical and environmental regulators to the potential harmful effects of these products instead of only disseminating their benefits. One way to reach this audience is with the realization and dissemination of ecotoxicological and mutagenicity studies that impartially analyze the real risks of excessive use of certain chemicals, suggesting appropriate maximum dosages that would have a great influence on the environment. With this study, the genotoxic and mutagenic effects of glyphosate-Roundup Original® formulation in tadpoles of Dendropsophus minutus (Peters, 1872) were demonstrated. And thus, it was observed that exposure of susceptible organisms, such as the larvae of frogs, to concentrations of 0.28mg / L glyphosate was sufficient to cause significant damage to the DNA, suggesting that the use of Roundup Original® in cultivable areas should be controlled, so as not to interfere with fauna in these regions. Concentrations greater than 1mg / L glyphosate possibly cause more severe damage that could lead to death of the affected cells, masking the results of the mutagenicity tests; however, this hypothesis can be confirmed with new ecotoxicological studies. Moreover, if these findings can be extended to other animal species and humans, it remains an open question, which requires further study. Finally, the application of Roundup Original® by farmers, and its consequences for the environment, certainly deserve more attention.

75

5.

REFERENCES

Al-Sabti K. 2000. Chlorotriazine Reactive Azo Red 120 Textile Dye Induces Micronuclei in Fish. Ecotoxicology and Environmental Safety 47(2):149–155. doi: 10.1006/eesa.2000.1931 Alford R.A., Richards S.J. 1999. Global Amphibian Declines: A Problem in Applied Ecology. Annual Review of Ecology and Systematics 30(1):133–165. doi: 10.1146/annurev.ecolsys.30.1.133 Ali D., Nagpure N.S., Kumar S., Kumar R., Kushwaha B. 2008. Genotoxicity assessment of acute exposure of chlorpyrifos to freshwater fish Channa punctatus (Bloch) using micronucleus assay and alkaline single-cell gel electrophoresis. Chemosphere 71(10):1823–1831. doi: 10.1016/j.chemosphere.2008.02.007 Alvarez-Moya C., Silva M. R.,Valdez Ramírez C., Gallardo D. G., León Sánchez R., Aguirre A.C., Velasco A.F. 2014. Comparison of the in vivo and in vitro genotoxicity of glyphosate isopropylamine salt in three different organisms. Genetics and Molecular Biology 37(1):105– 110. doi: 10.1590/S1415-47572014000100016 Anitha B., Chandra N., Gopinath P., Durairaj G. 2000. Genotoxicity evaluation of heat shock in gold fish (Carassius auratus). Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 469(1):1–8. doi: 10.1016/S1383-5718(00)00029-2 Beebee T.J.C., Griffiths R.A. 2005. The amphibian decline crisis: A watershed for conservation biology? Biological Conservation 125(3):271–285. doi: 10.1016/j.biocon.2005.04.009 Bernal M.H., Solomon K.R., Carrasquilla G. 2009. Toxicity of Formulated Glyphosate (Glyphos) and Cosmo-Flux to Larval and Juvenile Colombian Frogs 2. Field and Laboratory Microcosm Acute Toxicity. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A 72(15–16): 966–973. doi: 10.1080/15287390902929717 Bishop C.A., Mahony N.A., Struger J., Ng P., Pettit K.E. 1999. Anuran development, density and diversity in relation to agricultural activity in the Holland River watershed, Ontario, Canada (1990-1992). Environmental Monitoring and Assessment 57(1): 21–43. doi: 10.1023/A:1005988611661 Blaustein A.R., Wake D.B. 1990. Declining amphibian populations: A global phenomenon? Trends in Ecology Evolution 5(7): 203–204. doi: 10.1016/0169-5347(90)90129-2 Brausch J.M., Smith P.N. 2007. Toxicity of three polyethoxylated tallowamine surfactant formulations to laboratory and field collected fairy shrimp, Thamnocephalus platyurus. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 52(2):217–221. doi: 10.1007/s00244-0060151-y Braz-Mota S., Sadauskas-Henrique H., Duarte R.M., Val A.L., Almeida-Val V.M.F. 2015. Roundup® exposure promotes gills and liver impairments, DNA damage and inhibition of brain cholinergic activity in the Amazon teleost fish Colossoma macropomum. Chemosphere 135:53– 60. doi: 10.1016/j.chemosphere.2015.03.042

76

Bury, R. B. (2008). Low thermal tolerances of stream amphibians in the Pacific Northwest: Implications for riparian and forest management. Applied Herpetology 5, 63–74. Cabagna M.C., Lajmanovich R.C., Peltzer P.M., Attademo A. M., Ale E. 2006. Induction of micronuclei in tadpoles of Odontophrynus americanus (Amphibia: Leptodactylidae) by the pyrethroid insecticide cypermethrin. Toxicological Environmental Chemistry 88(4):729–737. doi: 10.1080/02772240600903805 Cavalcante D.G.S.M., Martinez C.B.R., Sofia S.H. 2008. Genotoxic effects of Roundup® on the fish Prochilodus lineatus. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 655(1–2): 41–46. doi: 10.1016/j.mrgentox.2008.06.010 Ç v ş T. Kön n S. 2007. D t t on o yto n t n DNA m n p r p r l ryt ro yt s of goldfish (Carassius auratus) exposed to a glyphosate formulation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis 22(4): 263–268. doi: 10.1093/mutage/gem012 Clements C., Ralph S., Petras M. 1997. Genotoxicity of select herbicides in Rana catesbeiana tadpoles using the alkaline single-cell gel DNA electrophoresis (Comet) assay. Environmental and Molecular Mutagenesis 29(3): 277–288. doi: 10.1002/(SICI)10982280(1997)29:3<277::AID-EM8>3.0.CO;2-9 Costa R.N., Nomura F. 2016. Measuring the impacts of Roundup Original ® on fluctuating asymmetry and mortality in a Neotropical tadpole. Hydrobiologia 765(1): 85–96. doi: 10.1007/s10750-015-2404-0 Conama. 2005. Resolução nº 357. Diário Oficial da União. Brasília. Cox C., Surgan M. 2006. Unidentified Inert Ingredients in Pesticides: Implications for Human and Environmental Health. Environmental Health Perspectives 114(12):1803-1806. doi: 10.1289/ehp.9374 Dalton R. 2000. WWW project aims to address worldwide decline in amphibians. Nature 403(6769):471–472. doi: 10.1038/35000721 Davidson C., Bradley S.H., Jennings M.R. 2001. Declines of the California Red-legged frog climate, UV-B, habitai and pesticides hypotheses. Ecological Applications 11(2):464–479. doi: 10.1890/1051-0761(2001)011[0464:DOTCRL]2.0.CO;2. De Amarante Junior O.P., dos Santos T.C.R., Brito N.M., Ribeiro M.L. 2002. Glifosato: Propriedades, toxicidade, usos e legislação. Quimica Nova 25(4):589–593. doi: 10.1590/S010040422002000400014. De Assis A.B. 2012. Microbiota, secreções cutâneas e microclima: consequências para os anfíbios. Revista Da Biologia 8:45–48. doi: 10.7594/revbio.08.08 De Basea M.B., Porta M., Alguacil J., Puigdomenech E., Gasull M., Garrido J.A, Lopez T. 2011. Relationships between occupational history and serum concentrations of organochlorine compounds in exocrine pancreatic cancer. Occupational and Environmental Medicine 68(5):332–338. doi: 10.1136/oem.2009.054197.

77

De Boer J., Hoeijmakers J.H. 2000. Nucleotide excision repair and human syndromes. Carcinogenesis 21(3):453–460. doi: 10.1093/carcin/21.3.453 Dearfield K.L., Cimino M.C., McCarroll N.E., Mauer I., Valcovic L.R. 2002. Genotoxicity risk assessment: a proposed classification strategy. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 521(1–2):121–135. doi: 10.1016/S1383-5718(02)00236-X Edginton A.N., Sheridan P.M., Stephenson G.R., Thompson D. G., Boermans H.J. 2004. Comparative effects of pH and Vision herbicide on two life stages of four anuran amphibian species. Environmental Toxicology and Chemistry / SETAC 23(4):815–822. doi: 10.1897/03-115 Edwards W.M., Triplett G.B., Kramer R. M. 1980. A Watershed Study of Glyphosate Transport in Runoff1. Journal of Environment Quality 9(4):661. doi: 10.2134/jeq1980.00472425000900040024x Fenech M. 2000. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 455(1–2):81–95. doi:10.1016/S0027-5107(00)00065-8 Feng J.C., Thompson D.G. 1990. Fate of glyphosate in a Canadian forest watershed. 2. Persistence in foliage and soils. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38(4):1118–1125. doi: 10.1021/jf00094a046 Ferreira C.M., Lombardi J.V., Machado-Neto J.G., Bueno-Guimarães H.M., Soares S.R.C., Saldiva P.H.N. 2004. Effects of copper oxychloride in Rana catesbeiana tadpoles: Toxicological and bioaccumulative aspects. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 73(3):465–470. doi: 10.1007/s00128-004-0452-7 Figueiredo J., Rodrigues D. 2014. Effects of four types of pesticides on survival, time and size to metamorphosis of two species of tadpoles (Rhinella marina and Physalaemus centralis) from the southern Amazon, Brazil. Herpetological Journal 24: 65–68. Giesy J.P., Dobson S., Solomon K.R. 2000. Ecotoxicological Risk Assessment for Roundup® Herbicide. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 167:35-120. doi: 10.1007/978-1-4612-1156-3_2 Goldsborough L.G., Beck A.E. 1989. Rapid dissipation of glyphosate in small forest ponds. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 18(4):537–544. doi: 10.1007/BF01055020. Gosner K. 1960. A Simplified Table for Staging Anuran Embryos and Larvae with Notes on Identification. Herpetologica 16:183–190. Gyori B.M.,Venkatachalam G., Thigarajan P.S; Hsu D; Clement M. 2014. Open Comet: An automated tool for comet assay image analysis. Redox Biology 9(2): 457-465. doi: 10.1016/j.redox.2013.12.020 Helander M., Saloniemi I., Saikkonen K. 2012. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science 17(10):569–574. doi: 10.1016/j.tplants.2012.05.008

78

Hopkins W.A. 2007. Amphibians as Models for Studying Environmental Change. ILAR Journal 48(3):270–277. doi: 10.1093/ilar.48.3.270 Howe C. M., Berrill M., Pauli B.D., Helbing C.C., Werry K., Veldhoen N. 2004. Toxicity of glyphosate-based pesticides to four North American frog species. Environmental Toxicology and Chemistry 23(80):1928–1938. doi: 10.1897/03-71 Huey, R. B. (1974). Behavioral thermoregulation in lizards: importance of associated cost. Science 184, 1001–1003. Huey, R. B. e Stevenson, R. D. (1979). Integrating physiology and ecology of ectotherms: a discussion of approaches. American Zoologist 19, 357–366. Hutchison, V. H. e Dupré, R. K. (1992). Thermoregulation. In: Ferder, M.E., Burggren, W.M. (Eds.), Environmental Physiology of the Amphibians. Chicago: The University of Chicago Press, pp. 206–249. Jiraungkoorskul W., Upatham E.S., Kruatrachue M., Sahaphong S., Vichasri-Grams S., Pokethitiyook P. 2003. Biochemical and histopathological effects of glyphosate herbicide on nile tilapia (Oreochromis niloticus). Environmental Toxicology 18(4);260–267. doi: 10.1002/tox.10123 Jones D.K., Hammond J.I., Relyea, R.A. 2011. Competitive stress can make the herbicide Roundup® more deadly to larval amphibians. Environmental Toxicology and Chemistry 30(2): 446–454. doi: 10.1002/etc.384 King J.J., Wagner R.S. 2010. Toxic Effects of the Herbicide Roundup® Regular on Pacific Northwestern Amphibians. Northwestern Naturalist 91(3):318–324. doi: 10.1898/NWN09-25.1 Lajmanovich R., Lorenzatti E., Maitre M. I., Enrique S., Peltzer, P. 2003. Comparative acute toxicity of the commercial herbicides glyphosate to neotropical tadpoles Scinax nasicus (Anura: Hylidae). Fresenius Environmental Bulletin 12(4): 364–367. doi: 10.1007/s00128-003-0029-x López González E.C., Latorre M.A., Larriera A., Siroski P.A., Poletta G.L. 2013. Induction of micronuclei in broad snouted caiman (Caiman latirostris) hatchlings exposed in vivo to Roundup® (glyphosate) concentrations used in agriculture. Pesticide Biochemistry and Physiology 105(2):131–134. doi: 10.1016/j.pestbp.2012.12.009 Mann R.M., Bidwell J.R. 1999. The toxicity of glyphosate and several glyphosate formulations to four species of southwestern australian frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 36(2):193–199. doi: 10.1007/s002449900460 Meza-Joya F.L., Ramírez-Pinilla M.P., Fuentes-Lorenzo J.L. 2013. Toxic, cytotoxic, and genotoxic effects of a glyphosate formulation (Roundup®SL-Cosmoflux®411F) in the directdeveloping frog Eleutherodactylus johnstonei. Environmental and Molecular Mutagenesis 54(5):362–373. doi: 10.1002/em.21775 Nájera–Hillman E., King P., Baird A.C., Breen B.B. 2009. Effect of pest–management operations on the abundance and size–frequency distribution of the New Zealand endemic frog Leiopelma hochstetteri. New Zealand Journal of Zoology, 36(4): 389–400. 79

Navas C.A., Gomes F.R., Carvalho J.E. 2008. Thermal relationships and exercise physiology in anuran amphibians: Integration and evolutionary implications. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular Integrative Physiology 151(3):344–362. doi: 10.1016/j.cbpa.2007.07.003 Navas, C. A., Úbeda, C. A., Logares, R., Jara, F. G. (2010). Thermal tolerances in tadpoles of three species of Patagonian anurans. South American Journal of Herpetology 5, 89–96. Nepomuceno J.C., Ferrari Í., Spanó M.A., Centeno A.J. 1997. Detection of micronuclei in peripheral erythrocytes of Cyprinus carpio exposed to metallic mercury. Environmental and Molecular Mutagenesis 30(3):293–297. doi: 10.1002/(SICI)1098-2280(1997)30:3<293::AIDEM7>3.0.CO;2-M Noland, R. e Ultsch, G. R. (1981). The roles of temperature and dissolved oxygen in microhabitat selection by the tadpoles of a frog (Rana pipiens) and a toad (Bufo terrestris). Copeia 1981, 645–652. Perkins P.J., Boermans H.J., Stephenson G.R. 2000. Toxicity of Glyphosate and Triclopyr Using the Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus. Environmental Toxicology and Chemistry 19(4):940–945. doi: 10.1897/1551-5028(2000)019<0940:TOGATU>2.3.CO;2 Peters W. 1872. Ueber eine Sammlung von Batrachien aus Neu-freiburg in Brasilien. Field Museum of Natural History 29:153–160. P m nt B.V.S. 2005. Comm nt on “St tus n Tr nds of Amphibian Declines and Extinctions Worl w .” Science 309(5743):1999b–1999b. doi: 10.1126/science.1112996 Pounds J.A., Bustamante M.R., Coloma L.A., Consuegra J.A., Fogden M.P.L., Foster P.N.,Young B.E. 2006. Widespread amphibian extinctions from epidemic disease driven by global warming. Nature 439(7073):161–7. doi: 10.1038/nature04246 Queiroz G.M.P., Silva M.R., da Bianco R.J.F., Pinheiro A., Kaufmann V. 2011. Transporte de glifosato pelo escoamento superficial e por lixiviação em um solo agrícola. Química Nova 34(2):190–195. doi: 10.1590/S0100-40422011000200004 Ramírez O.A., Garcia F.P. 2005. Genotoxic damage in zebra fish (Danio rerio) by arsenic in waters from Zimapan, Hidalgo, Mexico. Mutagenesis 20(4):291-295. doi: 10.1093/mutage/gei039 R Development Core Team. 2008. R: A language and environment for statistical computing. Available from: http://www.R-project.org/. Relyea R.A. 2003. Predator cues and pesticides: a double dose of danger for amphibians. Ecological Applications 13(6):1515–1521. doi:10.1890/02-5298 Relyea R.A. 2005a. The Lethal Impact of roundup® on aquatic and terrestrial amphibians. Ecological Applications, 15(4), 1118–1124. doi: 10.1890/04-1291

80

Relyea, R. A. 2005b. The impact of insectides and herbicides on the biodiversity and productivity of aquatic communities. Ecological Applications 15(2): 618–627. doi: 10.1890/035342. Relyea R.A. 2011. Amphibians Are Not Ready for Roundup ®. In Wildlife Ecotoxicology: Forensic Approaches 3:267-300. doi: 10.1007/978-0-387-89432-4_9 Relyea R.A., Jones D.K. 2009. The toxicity of Roundup Original ® Max to 13 species of larval amphibians. Environmental Toxicology and Chemistry 28(9):2004–2008. doi: 10.1897/09-021.1 Rissoli R.Z., Abdalla F.C., Costa M.J., Rantin F.T., McKenzie D.J., Kalinin A.L. 2016. Effects of glyphosate and the glyphosate based herbicides Roundup Original® and Roundup Transorb® on respiratory morphophysiology of bullfrog tadpoles. Chemosphere 156:37–44. doi: 10.1016/j.chemosphere.2016.04.083 Rodrigues H.G., Penha-Silva N., de Araújo M.F.P., Nishijo H. Aversi-Ferreira T.A. 2011. Effects of Roundup pesticide on the stability of human erytrocyte membranes and micronuclei frequency in bone marrow cells of Swiss mice. The Open Biology Journal 4:54-59. Sanseveriano A.M., Nessimian J.L. 2008. Assimetria Flutuante Em Organismos Aquáticos E Sua Aplicação Para Avaliação De Impactos Ambientais. Oecologia Australis 12(3):382–405. doi: 10.4257/oeco.2008.1203.03 Schaumburg L.G., Siroski P.A., Poletta G.L., Mudry M.D. 2016. Genotoxicity induced by Roundup® (Glyphosate) in tegu lizard (Salvator merianae) embryos. Pesticide Biochemistry and Physiology 130:71–78. doi: 10.1016/j.pestbp.2015.11.009 Schiesari L., Grillitsch B. 2011. Pesticides meet megadiversity in the expansion of biofuel crops. Frontiers in Ecology and the Environment 9(4):215–221. doi: 10.1890/090139 Schiesari L., Waichman A., Brock T., Adams C., Grillitsch B. 2013. Pesticide use and biodiversity conservation in the Amazonian agricultural frontier. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 368:1-9. doi: 10.1098/rstb.2012.0378 Shaw, G. 1802. General Zoology or Systematic Natural History. Volume III, Part 1. Amphibia. Thomas Davison. London. Shiogiri N.S., Paulino M.G., Carraschi S.P., Baraldi F.G., da Cruz C., Fernandes M.N. 2012. Acute exposure of a glyphosate-based herbicide affects the gills and liver of the Neotropical fish, Piaractus mesopotamicus. Environmental Toxicology and Pharmacology 34(2):388–396. doi: 10.1016/j.etap.2012.05.007 Silvano D., Azevedo-Ramos C., La Marca E., Coloma L., Ron S., Langone J., Hardy J. 2010. Dendropsophus minutus. doi: 10.2305/IUCN.UK.2010-2.RLTS.T55565A11332552 Simioni F., Silva D.F.N., da Mott T. 2013. Toxicity of Glyphosate on Physalaemus albonotatus (Steindachner , 1864) from Western Brazil. Ecotoxicology of Environmental Contamination 8(1):55–58. doi: 10.5132/eec.2013.01.008 Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L.1988. A simple technique for quantitation of

81

low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research 175(1):184–191. doi: 10.1016/0014-4827(88)90265-0

Sparling D.W., Linder G., L., Bishop C.A., Krest S. 2002. Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. Copeia, 2002(1), 249–251. doi: 10.1643/0045-8511(2002)002[0249:]2.0.CO;2 StatSoft Inc. 2004. Statistica (data analysis software system), version 7. Available from: www.statsoft.com. Steindachner F. 1864. Batrachologische Mittheilungen. Verhandlungen Des ZoologischBotanischen Vereins in Wien, 14:239–288. Stuart S.N. 2004. Status and Trends of Amphibian Declines and Extinctions Worldwide. Science 306(5702):1783–1786. doi: 10.1126/science.1103538 Thompson D. 2004. Potential effects of herbicides on native amphibians: A hierarchical approach to ecotoxicology research and risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry 23(4):813–814. doi: 10.1897/1551-5028(2004)023<0813:PEOHON>2.0.CO;2 Toledo L.F., Carvalho-e-Silva S. P., de Sánchez C., Almeida M. A.De, Haddad C.F.B. 2010. A revisão do Código Florestal Brasileiro: impactos negativos para a conservação dos anfíbios. Biota Neotropica 10(4):0–0. doi: 10.1590/S1676-06032010000400003 Ultsch, G. R., Bradford, D. F. e Freda, J. (1999). Physiology: coping with the environment. Pp. 189–214 n R.W. M ‐D rm n R. Alt s. T pol s: T B olo y o Anur n L rv . Chicago: University of Chicago Press. Vera B., Santa Cruz S., Magnarelli G. 2012. Plasma cholinesterase and carboxylesterase activities and nuclear and mitochondrial lipid composition of human placenta associated with maternal exposure to pesticides. Reproductive Toxicology 34(3):402–407. doi: 10.1016/j.reprotox.2012.04.007 Vitt L.J., Caldwell J.P., Wilbur H.M., Smith D.C. 1990. Amphibians as harbingers of decay. BioScience 40(6):418–418. doi: 10.1093/bioscience/40.6.418 Weygoldt P. 1989. Changes in the composition of mountain stream frog communities in the Atlantic mountains of Brazil: Frogs as indicators of environmental deteriorations? Studies on Neotropical Fauna and Environment 24(4):249–255. doi: 10.1080/01650528909360795 Wu C.‐S. K m Y.‐C. (2005). T rm l tol r n n t rmor ul t on y T w n s Rhacophorid tadpoles (Buergeria japonica) living in geothermal hot springs and streams. Herpetologica 61, 35–46. Yadav S.S., Giri S., Singha U., Boro F., Giri A. 2013. Toxic and genotoxic effects of Roundup® on tadpoles of the Indian skittering frog (Euflictis cyanophlyctis) in the presence and absence of predator stress. Aquatic Toxicology 15:132–133, doi: 10.1016/j.aquatox.2013.01.016 Zar J.H. 2007. Biostatistical Analysis. Pearson. Upper Saddle River.

82

CAPÍTULO III

Dna damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides on Rhinella arenarum (anura, bufonidae) tadpoles

Celeste Ruiz de Arcautea,b,*, Juan Manuel Pérez Iglesias, a,b,*, Wanessa Fernandes Carvalhoa,c, Milagros Labordea,d, Luciano Torresa, Sonia Soloneskia,b and Marcelo L. Larramendya,b a

Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, Calle 64 Nº 3, B1904AMA La Plata, Argentina

b

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina

c

Depto. de Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Brazil

d

National Agency of Scientific and Technological Promotion (ANPCyT), Argentina Running title: Genotoxicity of glyphosate and imazethapyr mixtures in Rhinella arenarum

83

ABSTRACT Glyphosate (GLY) andimazethapyr (IMZT) are two herbicides commonly used worldwide, either alone or in mixtures.They represent key pesticides in modern agricultural management worldwide. However, the toxicity and interactions which result when applied as mixtures have not been characterized so far. The acute toxicity of the 48% GLY-based Credit® and the 10.59% IMZT-based Pivot® H alone and their binary combinations was analyzed in Rhinella arenarum tadpoles exposed in a semi-static renewal test. Lethal effects were determined using mortality as the end-point, whereas sublethal effects were determined using the single-cell gel electrophoresis (SCGE) bioassay. Based on mortality experiments, the LC5096

h

value for

GLY was 78.18 mg/L and for IMZT 0.99 mg/L with Credit® and Pivot® H, respectively. A dosedependent increase in the genetic damage index (GDI) was found after exposure to Credit® or Pivot® H at 5% and 10% of LC5096

h

values.The combinations of 5% Credit®-5% Pivot® H

LC5096 h and 10% Credit®-10% Pivot® H LC5096 h concentrations significantly enhanced the GDI in comparison with tadpoles exposed only to Credit® or Pivot® H. Thus, the effect of interaction between GLY and IMZT on the generation of DNA damage in R. arenarum blood cells can be considered to be synergistic. Furthermore, our observations constitute the first report of the induction of IMZT-exerted acute lethal and sublethal effects in R. arenarum tadpoles.

Keywords Amphibians; Credit®; Comet assay; Herbicide binary mixture; Lethal/sublethal effects; Pivot® H

84

1. INTRODUCTION Agricultural practices release extensive amounts of pesticides into soil, water and air (Ippolito et al. 2015; Liaud et al. 2016), introducing large amounts of xenobiotics to move freely into diverse environmental compartments, since only less than 0.1% of the total amount of agrochemicals applied around the world reach their targets (Pimentel et al. 1993). Thus, a complex mixture of products reaches, not only their target species, but also non-target species from terrestrial and aquatic biota (Liang et al. 2013; Meffe and de Bustamante 2014). Currently, the application of mixtures of toxicants is a commonly used strategy to control weeds and prevent weed resistance, despite of the potential effect that the mixture could exert on non-target organisms (Ge et al. 2014). Consequently, mixtures of pesticides should be considered as an additional important group of environmental contaminants (Lydy et al. 2004). Furthermore, chemicals present in mixtures can cause complex changes rather than the toxic effects exerted by individual compounds (LeBlanc and Wang 2006; Silva et al. 2015; Soloneski et al. 2016; Svartz et al. 2016; Varona-Uribe et al. 2016). In general terms, a mixture of toxicants may exert three categories of joint action, additivity, synergism and antagonism (Brodeur et al. 2014; Calabrese 1995; Calamari and Alabaster 1980; Lydy et al. 2004; Soloneski et al. 2016; Warne 2003). So far, the complex interactions between pesticides in combination and their toxic effects have been poorly studied. Thus, the need to evaluate the combined effects of pesticides in mixtures, especially those with interactions between at least two components, in other words binary mixtures, has been suggested (Warne 2003). Amphibians in developmental early stages belong to the aquatic biota. They are sensitive to any change in the environment and represent one of the most threatened and rapidly declining organisms worldwide (Brooks et al. 2016; Egea-Serrano et al. 2012; Ficetola and Maiorano 2016). It has been claimed that the decline in amphibia is predominantly related to pesticide pollution in natural and agricultural areas (Beebee 2005; Egea-Serrano et al. 2012; Jones et al. 2009, 2010; Mann et al. 2009; Sparling and Fellers 2009; Wagner et al. 2014, 2015). Amphibians in particular are threatened by aquatic pollution due to their unprotected eggs and sensitive skin. In addition, their populations are adversely affected by other factors, such as habitat modifications, diseases and the presence of exotic species (Bradford et al. 2011; Brühl et al. 2011; Mann et al. 2009; Sparling and Fellers 2009). Rhinella arenarum (Hensel, 1867), a toad belonging to the family Bufonidae, inhabits the Argentinean humid Pampas where the application of pesticides is a common practice in crops of

85

economical interest. The species reproduces in shallow, temporary and semi-temporary ponds or bogs formed within this agroecosystem. Agrochemical activities performed in these or neighboring fields may affect amphibians, including R. arenarum (Agostini et al. 2009; Babini et al. 2016). Based on the wide distribution of the species, its broad range of habitats and large populations, R. arenarum has been classified as least concerns among the anuran species (Kwet et al. 2004). Information demonstrating that amphibians represent useful and valid environmental indicators for environmental monitoring has been reported throughout the literature (Brodeur et al. 2013; Burlibasa and Gavrila 2011; Kehoe et al. 2015; Larramendy 2017a, b; Pérez-Iglesias et al. 2014, 2015, 2017; Ruiz de Arcaute et al. 2014; Wu et al. 2013). In addition, several previous studies have highlighted that larvae from R. arenarum can be considered to be an appropriate biotic matrix for the evaluation and quantification of pesticide- and other pollutant-induced toxicity, and for estimation of genomic instability in aquatic environments. Among these can be included several herbicides, such as 2,4-D, atrazine, glufosinate-ammonium, bispyribac-sodium, flurochloridone, glyphosate, metsulfuron-methyl and picloram (USEPA 2017, and references therein). Different end-points for evaluating both cytotoxicity and genotoxicity are used in aquatic vertebrates, including amphibians. Detection and quantification of damage induced in DNA by the single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay is one of the recommended and adopted genetic biomarkers for estimating genotoxicity and oxidative damage (Mouchet et al. 2006a, b, 2007; Nikoloff et al. 2014b; Pérez-Iglesias et al. 2014, 2015, 2017; Vera-Candioti et al. 2010). In amphibians, in particular, several reports show that the SCGE assay is avaluable technique for detecting the effects of pollution in different anthropied areas (Burlibasa and Gavrila 2011; Maselli et al. 2010; Meza-Joya et al. 2013; Ralph and Petras 1998), for screening for the harmful effects of xenobiotics (Meza-Joya et al. 2013; Mouchet et al. 2007; Nikoloff et al. 2014b; PérezIglesias et al. 2014, 2015, 2017; Ruiz de Arcaute et al. 2014; Vera-Candioti et al. 2010), and recently, for analysing the combined effects of xenobiotics when applied as mixtures (Soloneski et al. 2016). The current study examines the acute toxicity of glyphosate (GLY) and imazethapyr (IMZT) formulations, used alone and as a binary mixture in Rhinella arenarum tadpoles using a semi-static renewal test. Acute lethal effects were determined using mortality as end-point; sublethal effects were evaluated in circulating blood cells employing the SCGE assay to detect genotoxic effects as the endpoint. The potential interactions resulting from the mixture of these herbicides, such as additivity, synergism, or antagonism, were evaluated. 86

2.

MATERIAL AND METHODS

2.1. Chemicals The commercial products Credit® and Pivot® H were employed for testing GLY [N(phosphonomethyl) glycine; CAS 1071-83-6] and IMZT [5-ethyl-2-(4-isopropyl-4-methyl-5oxo-4,5-dihydroimidazol-1H-2-yl) nicotinicacid; CAS 81335-77-5], respectively. Credit® is a GLY-based commercial formulation containing 48% of isopropylamine salt (Dow AgroSciences Argentina S.A., Argentina). Pivot® H is a trade product containing 10.59% of IMZT (BASF Argentina S.A., Argentina). The two herbicide formulations used contained proprietary adjuvants of unknown identity, as this information was not provided by the manufacturers. Cyclophosphamide (CP; CAS 6055-19-2) and all other chemicals of analytical grade were provided by Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO), except K2Cr2O7 [Cr(VI); CAS 7778-50-9] which was purchased from Merck KGaA (Darmstadt, Germany).

2.2. Quality control Concentrations of GLY and IMZT in test solutions were determined by QV Chem Laboratory (La Plata, Buenos Aires, Argentina) using high-performance liquid chromatography and following the OSHA Analytical Method PV2067 and U.S. Geological Survey Report 014134 (Furlong et al. 2011), respectively. Concentration of analytes in test solutions (720 mg/L for Credit® and 0.78, 1.17 and 1.63 mg/L for Pivot® H) were determined immediately after preparation (0 h) and at 24 h thereafter. The limit of detection was 0.2 mg/L and 0.5 µg/L for GLY for IMZT, respectively.

2.3.

Anuran tadpoles Rhinella arenarum has a wide Neotropical distribution in Argentina, Bolivia, Brazil,

Uruguay and Paraguay. Tadpoles were collected from a temporary, uncontaminated pond near L Pl t

ty (35°10′S 57°51′W Bu nos A r s Prov n

(GS9)

or n

to Gosn r‟s

l ss

Ar nt n ) t st

9o

v lopm nt

t on (Gosner 1960). Hatches were acclimated to

laboratory conditions in a 16/8 light-dark cycle with dechlorinated tap water (temperature 25.0 ± 1ºC; pH 7.5 ± 0.1; dissolved oxygen 6.4 ± 0.3 mg/L; conductivity 994 ± 8.5 μS/cm; hardness 142 ± 21.5 mg CaCO3/L) until the beginning of the experiment (Nikoloff et al. 2014b; Soloneski et

87

al. 2016). Individuals were maintained following the recommendations of the Argentinean National Service for Sanitary and Quality of Agriculture and Food (SENASA) guideline 617/2002 for biological testing (SENASA 2013). Once tadpoles reached GS36 (range 35--37), acute lethal and sublethal tests were conducted to determine mortality and DNA single-strand breaks. For each end-point, ten larvae were kept in a 1-L glass container and exposed to herbicides for 96 h according to the experimental design (see section 2.4 and 2.5 for details).Tadpoles were not fed throughout the experiment.

2.4.

Determination of LC50 values Acute toxicity of IMZT was estimated according to the U.S. EPA (1975, 1982, 2002)

and ASTM (2007) standardised methods, with minor adaptations previously reported (PérezIglesias et al. 2014, 2015; Ruiz de Arcaute et al. 2014; Soloneski et al. 2016; Vera-Candioti et al. 2010). Dechlorinated tap water and Cr(VI) at 23 mg/L were employed as negative and positive controls, respectively. Solutions of herbicides were replaced every 24 h. Lethal effects were visually evaluated every 24 h. Individuals were considered dead when no response was observed after gently prodding with a glass rod. Four sets of experiments were performed simultaneously. LC50 values for the GLY contained in the formulated product Credit® had been determined previously in our laboratory by Soloneski et al. (2016).

2.5.

Single-cell gel electrophoresis assay Individuals were treated with two different concentrations each herbicide, equivalent to

5% and 10% of the LC5096 h value, either alone or in a binary mixture. Accordingly, tadpoles were exposed to Credit® at 3.91 and 7.82 mg/L and Pivot® H at 0.05 and 0.10 mg/L (see Section 2.4). Negative (dechlorinated tap water; see Section 2.4) and positive controls (CP at 40 mg/L) were run simultaneously with the Credit®- and Pivot® H-exposed tadpoles. After 96 h of exposure, tadpoles were anesthetized by immersion in ice water (ASIH 2004), and an aliquot of blood was obtained by sectioning behind the operculum. The alkaline SCGE assay was performed following the recommendations of Singh (1996), with modifications for anuran larvae reported elsewhere (Pérez-Iglesias et al. 2014, 2015, 2017; Ruiz de Arcaute et al. 2014; Soloneski et al. 2016). DNA damage was visually classified in 100 non-overlapping cells according to Ç v ş n Kon n (2007). Results were expressed as the mean number of damaged cells (sum of Classes II, III and IV). The genetic damage index (GDI) was estimated for each 88

experimental point according to the algorism of Pitarque et al. (1999): GDI = [I (I) + 2 (II) + 3 (III) + 4 (IV) / N (0--IV)], where 0--IV represents the nucleoid type, and N0--NIV represents the total number of nucleoids scored.

2.6.

Statistical analysis Results

for

lethality

were

estimated

according

to

the

Probit

method

(http://www.epa.gov/nerleerd/stat2.htm.) (Finney 1971). Other statistical analyses were performed using Statistica software, version 7.0. One-w y ANOVA w t Dunn tt‟s t st w s performed for analysis of SCGE data in order to determine significant differences from the control group. The relationship between concentration and GDI data was analysed using simple linear regression and correlation analyses. For all tests, the criterion for significance was 0.05, unless indicated otherwise.

3.

RESULTS

3.1. Chemical analysis Concentrations of the pure compound showed no significant variation (P> 0.05) in the test solutions after 24 h (concentration range 97 ± 5% recovery). The concentrations reported in the present study represent the nominal concentrations of the active ingredient, GLY or IMZT, contained in the formulations Credit® and Pivot® H, respectively.

3.2. Lethal end-points LC50 values for GLY and IMZT contained in the commercial formulations Credit ® and Pivot® H were determined after 24, 48, 72, and 96 h of exposure using Probit analysis. Acute toxicity of Credit® formulation on R. arenarum has been reported previously by Soloneski et al. (2016). In mortality experiments, LC50 values for GLY of 89.44 mg/L (82.68– 96.36 mg/L), 85.96 mg/L (65.02–113.66 mg/L), 82.08 mg/L (80.16–92.20 mg/L) and 78.18 mg/L (75.77–81.22 mg/L) were reported after 24, 48, 72 and 96 h of exposure, respectively. Regression analysis revealed a significant time-dependent increase in lethality when the time of exposure increased from 24 to 96 h (r = -0.99; P < 0.001) (Soloneski et al. 2016). Mortality data for IMZT showed the same LC50 value of 1.0 mg/L (0.91–1.12 mg/L) after 24, 48 and 72 h of exposure, whereas the LC50 value after 96 h of exposure was 0.99 mg/L 89

(0.91–1.08 mg/L). Regression analysis revealed that LC50 values were not affected by the exposure time from 24 to 96 h (r = -0.77; P > 0.05).

3.3. Sublethal end points: DNA damage Data from the SCGE assay are presented in Table 1 and Fig. 1. The mean frequencies of nucleoid categories and total damage induction are summarised in Table 1, whereas the GDI values are depicted in Fig. 1. CP exposure increased the frequency of damaged nucleoids as well as the GDI value compared to negative control values (P < 0.001; Table 1, Fig. 1). Such a result was due to an enhanced frequency of type II (P < 0.01), III (P < 0.001), and IV nucleoids (P < 0.001) and a concomitant decrease of type 0--I (undamaged) nucleoids (P < 0.001; Table 1). 3.3.1. Glyphosate-based herbicide-exposed larvae After 96 h of exposure to Credit®, GDI values in tadpoles exposed either to 5% (P < 0.05) and to 10% (P < 0.001) of the Credit® LC5096 h concentration were augmented compared to negative controls (Fig. 1). This increase was due to an increased frequency of type II nucleoids (P < 0.001) and a simultaneous decrease in the frequency of type 0--I nucleoids (P < 0.001) for tadpoles exposed to both 5% and 10% of the Credit® LC5096 h concentration (Table 1). 3.3.2. Imazethapyr-based herbicide-exposed larvae In tadpoles exposed to Pivot® H, enhanced GDI values were reported when tadpoles were exposed to both 5% and 10% of the LC5096 h concentration (P < 0.001; Fig. 1). The effect was due to an enhanced frequency of type II (P < 0.001) and III nucleoids (P < 0.01) and a simultaneous decreased frequency of type 0--I nucleoids (P < 0.001) when tadpoles were exposed to 5% of the LC5096 h concentration (Table 1). Similarly, a significant increase in the frequency of type II (P < 0.05), III (P < 0.001) and IV nucleoids (P < 0.01) and a concomitant decreased frequency of type 0--I nucleoids (P < 0.001) was observed in larvae treated with 10% of the Banvel® LC5096 h concentration (Table 1).

3.3.3. Glyphosate-plus imazethapyr-based herbicide-treated larvae The combination of Credit® and Pivot® H induced a significant dose-dependent increase in the GDI compared to negative control values, as well as compared to those values in larvae

90

exposed to Credit® or Pivot® H only (P < 0.001; Fig.1). For both mixture concentrations, such an effect was due to an enhanced frequency of type III and IV nucleoids and a concomitant decrease of type 0--I nucleoids (P < 0.001; Table 1). In addition, a significant increase in frequency of type II nucleoids was observed in tadpoles exposed to Credit®-Pivot® H at 5% LC5096

h

concentration (P < 0.05), but not with Credit®-Pivot® H at 10% LC5096 h concentrations (P > 0.05) (Table 1). In addition, significant differences between the GDI in tadpoles exposed to Credit®-Pivot® H at 5% LC5096 h concentrations and those exposed to Credit®-Pivot® H at 10% LC5096

h

concentrations (P< 0.001; Fig. 1). Overall, treatment with Credit®-Pivot® H at 5%

LC5096 h concentrations induced 1.63- and 1.33-fold increases in the GDI over those induced by 5% Credit® LC5096 h and 5% Pivot® H LC5096 h treatments, respectively. Similarly, 1.78- and 1.27-fold increases in the GDI occurred in larvae exposed to the mixture comprising Credit ®Pivot® H at 10% LC5096 h concentrations compared to those induced by 10% Credit® LC5096 h and 10% Pivot® H LC5096 h concentrations, respectively (Fig. 1).

Figure 1. DNA damage induced by Credit® (light grey bars) and Pivot® H (dark grey bars), detected by the single cell gel electrophoresis assay in Rhinella arenarum tadpoles exposed under laboratory conditions. Tadpoles were exposed for 96 h to either Credit® or Pivot® H at 5% and 10% of each LC5096 h concentration and to binary mixtures (black bars) of Credit®-Pivot® H at 5% of each LC5096 h concentration and 10% of each LC50 96 h concentration. Results are expressed as pooled values of genetic damage indexes from three independent experiments. Negative (NC; untreated larvae) controls and positive controls (PC; 40 mg/L cyclophosphamidetreated larvae) (white bars) were run simultaneously with herbicide-exposed tadpoles. *, P < 0.05; ***, P < 0.001 (significant differences compared to negative control values). ##, P < 0.01; ### , P < 0.001 (significant differences compared to herbicide-alone values).

91

Table 1. Analysis of DNA damage estimated by the single-cell gel electrophoresis assay in peripheral blood cells of Rhinella arenarum tadpoles exposed to GLY-based Credit® and IMZT-based Pivot® H commercial formulations. Chemicals

Number Number of animals of cells observed analyzed

Nucleoids Categories % ± SE % of damaged cells (II+III+IV)

Type 0+I

Type II

Type III

Type IV

84.49 ± 9.32

10.47 ± 1.47

2.87 ± 0.59

2.17 ± 0.72

15.51 ± 1.56

8.26 ± 1.81 8.00 ± 1.66#

6.10 ± 2.12 5.68 ± 1.76

56.10 ± 8.23*** 68.00 ± 6.52***

Negative control

10

1012

GLY 5% LC5096 h 10% LC5096 h

10 10

1114 1250

43.90 ± 7.22*** 41.74 ± 10.01*** 32.00 ± 7.59*** 54.32 ± 4.36***

IMZT 5% LC5096 h 10% LC5096 h

10 10

1154 920

16.45 ± 7.41*** 18.59 ± 8.10***

39.51 ± 5.54*** 25.76 ± 6.96*

17.54 ± 3.56** 27.93 ± 6.29***

10.57 ± 5.15 27.72 ± 10.31**

68.02 ± 9.42*** 81.41 ± 7.78***

Mixture 5% LC5096 h GLY+5% LC5096 h IMZT 10% LC5096 h GLY+10% LC5096 h IMZT

10 10

1079 1069

14.37 ± 3.28*** 5.71 ± 3.05***

27.53 ± 4.36* 6.79 ± 2.14

29.01 ± 5.27*** 10.94 ± 2.54***

29.10 ± 6.92*** 28.34 ± 4.48***

85.63 ± 5.43*** 94.29 ± 7.76***

Positive controlb

10

1230

19.76 ± 5.37***

37.80 ± 9.53**

24.23 ± 4.89***

16.40 ± 3.93**

80.24 ± 8.22***

a, GDI: Genetic damage index. b, Cyclophosphamide (CP, 40 mg/L) was used as positive control. *,P < 0.05;**,P < 0.01; ***,P < 0.001; significant differences with respect to negative control values. #,P < 0.05; ##,P < 0.01; ###,P < 0.001; significant differences with respect to herbicide alone exposed tadpole values.

92

4.

DISCUSSION In addition to acute lethal effects, the possible toxic interactions (synergy,

antagonism or additivity) prevailing in binary mixtures of two commercial herbicide formulations, the GLY-based Credit® and the IMZT-based Pivot® H, were analyzed. As the target organism, specimens of R. arenarum (Anura, Bufonidae) were exposed under laboratory conditions using a semi-static acute experimental model for toxicity testing. Our results showed LC5096 h values of 78.18 mg/L GLY and 0.99 mg/L IMZT for Credit® and Pivot® H, respectively. Concerning the acute lethality of the agrochemicals obtained in this study and according to the directives of the U.S. EPA for aquatic organisms (USEPA 2017), GLY and IMZT could be ranked as slightly and highly toxic compounds, respectively. In addition, GLY and IMZT can be classified as harmful compounds for aquatic biota (Category III) according to criteria established by the United Nations directives (UN 2011). In addition, whereas GLY should be considered as a harmful chemical, IMZT represents a chemical that may cause longterm adverse effects in the aquatic environment, according to the hazard classification categories contained in European Union regulations (Mazzatorta et al. 2002). The current results showed a LC5096 h value for IMZT in R. arenarum tadpoles of 0.99 mg/L (confidence limits 0.91–1.08 mg/L). So far, acute lethality data for IMZT in this species have not been reported. Thus, this study represents the first experimental data on acute lethality induced by IMZT in R. arenarum tadpoles. Recently, in a study of another native anuran species, the Montevideo tree frog Boana pulchella (formerly named Hypsiboas pulchellus) larvae, a LC5096

h

value for IMZT of 1.55 mg/L

(confidence limits, 1.51-1.60) was determined for the same commercial product, namely Pivot® H (Pérez-Iglesias et al. 2015). It seems evident then that B. pulchella is nearly 1.56 times less sensitive to IMZT than R. arenarum at the same premetamorphic developmental stage. Unfortunately, there are no available reports evaluating acute toxicity of other herbicides in both R. arenarum and B. pulchella or in larvae from other Neotropical anuran species. Thus, we cannot ensure that the observed pattern of R. arenarum being more sensitive to IMZT than B. pulchella would be repeated with other environmental stressors. Whether the higher sensitivity to IMZT that we observed in R. arenarum premetamorphic tadpoles compared to B. pulchella larvae is restricted to one of the herbicides under study or could be extended to other xenobiotics remains an open

93

question. Further studies are required to analyse this concept using a battery of different xenobiotics, including several other herbicides in this Neotropical anuran species. Our results agree with the widely accepted view that the SCGE assay is a useful and sensitive laboratory methodology for monitoring amphibians after exposure to xenobiotics, including pesticides (Burlibasa and Gavrila 2011; Feng et al. 2004; Maselli et al. 2010; Meza-Joya et al. 2013; Mouchet et al. 2007; Pérez-Iglesias et al. 2014, 2015; Vera-Candioti et al. 2010; Yin et al. 2008). However, information on the effects of xenobiotic exposure for Argentinean amphibian species is limited. Consistent with this concept and addressing the lack of information on the harmful effects exerted by a reduced number of pesticides in Argentinean amphibian species, we evaluatedthe lethal and sublethal toxicity of the herbicide flurochloridone contained in the two formulated products, Twin Pack Gold® and Rainbow® in R. arenarum tadpoles (Nikoloff et al. 2014b). B. pulchella tadpoles have been used as a non-conventional biotic matrix for the evaluation of lethal and sublethal effects of the neonicotinoid imidacloprid and its formulated product Glacoxan Imida (Pérez-Iglesias et al. 2014), as well as Pivot® H, the IMZT-based herbicide product (Pérez-Iglesias et al. 2015, 2017). Consequently, the current study represents the first in vivo experiment employing SCGE as a technique for detecting and quantifying DNA single-strand breaks caused by IMZT in peripheral blood cells of R. arenarum tadpoles. Nowadays, due to the modern agricultural practices, pesticides are often applied as mixtures of at least two different agrochemicals, in which they may interact with each other, resulting in diverging effects on biota, both target and non-target orgaisms (Baas et al. 2010; Belden and Lydy 2000; Rodney et al. 2013). Briefly, the interaction may cause and additive, synergistic, or antagonistic effects (Blouin et al. 2010). For a mixture, when a larger response is observed than the effects of each component applied singly, this is referred to as a synergistic pattern. In contrast, an antagonistic effect is when the interaction results in a reduction of the effect caused by any of the individual components. Finally, although rare, an additive effect is achieved when the resulting effect is equal or similar to the sum of the effects caused by each constituent (Warne, 2003). Our results clearly demonstrate that the binary mixtures of Pivot® H-Credit® at 5% LC5096 h concentrations, as well as Pivot® H-Credit® at 10% LC5096 h concentrations increased the GDI beyond the values obtained when tadpoles were exposed only to

94

Pivot® H or Credit®, in spite of the concentration of the pure compound present in the mixture. Consequently, a synergistic effect could be observed for the mixture of GLY and IMZT when the SGCE assay was employed to detect genotoxicity in R. arenarum tadpoles. Toxicity caused by binary combinations of the herbicides GLY and IMZT have not been reported so far. Reports are available of investigations of mixtures containing GLY and other agrochemicals in different biotic matrices, and synergistic effects were reported for most of them (Bielecki et al. 2004; Brodeur et al. 2014; Olszyk et al. 2015; Santos et al. 2011; Tatum et al. 2012). On the other hand, in an earlier study where the common wheat Triticum aestivum was exposed to GLY in binary combinations with aminoalkane and aminofluorenephosphonates at concentrations which approximated the respective EC50 values, either antagonistic or additive responses were reported (Bielecki et al. 2004). Similar findings were also reported by Brodeur et al. (2016) who demonstrated antagonistic toxicities of GLY- and cypermethrin-based pesticides in the fish Cnesterodon decemmaculatus. In a small number of studies, R. arenarum larvae have been employed as biotic matrix to study possible interaction of pesticide mixtures. In a previous study, equitoxic and nonequitoxic combinations of GLY, present in the commercial formulations Glifosato Atanor® and Glifolex®, and the insecticide cypermethrin, contained in the commercial formulations Xiper® and Glextrin®, demonstrated a synergistic effect that was able to influence the survival of R. arenarum tadpoles, regardless of the combinations (Brodeur et al. 2014). Recently, we employed the SCGE assay to evaluate genotoxicity caused by the interaction of GLY and dicamba when tadpoles of the species were acutely exposed for 96 h (Soloneski et al. 2016). Results demonstrated that both GLY and dicamba exerted DNA damage in blood cells. Additionally, both herbicides when applied as mixtures increased the levels of DNA damage to higher frequencies than those observed for each herbicide alone, thus demonstrating that GLY and dicamba act synergistically when applied together (Soloneski et al. 2016). Our current results demonstrate that the SCGE assay provides a powerful method for evaluating the genotoxicity exerted by mixtures of pesticides on a biotic matrix, specifically in anuran larvae. The current results could allow us to suggest that the high level of DNA damage induced by the combination of GLY and IMZT may give rise to a lower level of genomic stability and have a deleterious effect on several biological processes in exposed organisms, including development, behaviour, survival

95

outcome, reproduction and population fitness (Beebee 2005; Jones et al. 2009). Finally, it is important to note thatseveral commercial applications of GLY-IMZT mixtures are widely used in agricultural systems worldwide. So far, available information indicates that 12 formulated products containing a mixture of GLY and IMZT as active ingredients have been registered in Argentina (CASAFE 2013). Based on the results of this study, mixtures of GLY and IMZT herbicides could put at risk amphibian populations by producing synergistic DNA damage that they could magnify the harmful effects on non-target species inhabiting aquatic agroecosystems. Previously, the U.S. EPA (1982) highlighted that the toxic effects of a pure compound can differ from that of the commercial product carrying the active ingredient. The presence within commercial formulations of additive compounds, also called inerts, the identity of which is often kept confidential by the manufacturing companies, may cause different toxicity to that of the active ingredient and appears to be a distinctive attribute in the pesticide toxicology (Belden et al. 2010; Brühl et al. 2011; Grisolia et al. 2004; Mann and Bidwell 1999; Nikoloff et al. 2014a; Soloneski et al. 2007; Soloneski and Larramendy 2010). Accordingly, caution should be taken with the concept of the binary mixtures of two commercial formulations we assayed. The mixtures tested in the current study represent a much more complex scenario as they involved herbicide formulations which, themselves, are mixtures of several components. Furthermore, and extending this concept, we cannot assume that the proportion of each constituent of the mixtures we used follows the same or similar profile in an environmental aquatic system, as the different components may undergo different transformation or degradation in these conditions. Additional studies are necessary to determine whether the toxicity caused by the mixtures of Credit® and Pivot® H in the R. arenarum tadpoles is attributable to the active ingredients by themselves or result from the presence of additive compounds included in the herbicide formulated products.

5. ACKNOWLEDGEMENTS The authors acknowledge Guillermo S. Natale, Ph.D., for providing the R. arenarum specimens employed in the study. This study was supported by grants from the National University of La Plata (Grants 11/N746 and 11/N817), the National Council for Scientific and Technological Research (CONICET, PIP N° 0344) and the National Agency of Scientific and Technological Promotion (PICT 2015 Number 3059)

96

from Argentina. W. F rn n s C rv l o s t

r

p nt o

llows p rom “Pro r m

de Doutorado Sanduíche no Exterior (CAPES-PDSE-Edital nº 19/2016, Processo: 88881.135034-2016-01), who is also acknowledged. 6.

REFERENCES

Agostini MG, Natale GS, Ronco AE (2009) Impact of endosulphan and cypermethrin mixture on amphibians under field use for biotech soya bean production International. J Environ Health 3:379-389 ASIH (2004) Guidelines for use of live amphibians and reptiles in field and laboratory research. Herpetological Animal Care and Use Committee of the American Society of Ichthyologists and Herptetologists, Washington, DC ASTM (2007) Standard guide for conducting acute toxicity tests with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. Biological effects and environmental fate. ASTM E 729-96 Baas J, Stefanowicz AM, Klimek B, Laskowski R, Kooijman SA (2010) Model-based experimental design for assessing effects of mixtures of chemicals. Environ Pollut 158:115-120 Babini MS, Bionda CdL, Salas NE, Martino AL (2016) Adverse effect of agroecosystem pond water on biological endpoints of common toad (Rhinella arenarum) tadpoles. Environ Monitor Assess 188:459 Beebee TJ (2005) Conservation genetics of amphibians. Heredity 95:423-427 Belden J, McMurry S, Smith L, Reilley P (2010) Acute toxicity of fungicide formulations to amphibians at environmentally relevant concentrations. Environ Toxicol Chem 29:2477-2480 Belden JB, Lydy MJ (2000) Impact of atrazine on organophosphate insecticide toxicity. Environ Toxicol and Chem 19:2266-2274 B l k K S r puk J Kl sz zyńsk H (2004) B n ry m xtur s o (Nphosphonomethyl)-glycine with new aminophosphonates. Z Naturforsch C 59:515-518 Blouin D, Webster E, Bond J (2010) On a method of analysis for snergistic and antagonistic joint-action effects with fenoxaprop mixtures in rice (Oryza sativa). Weed Technol 24:583-589 Bradford DF et al. (2011) Pesticide distributions and population declines of California, USA, alpine frogs, Rana muscosa and Rana sierrae. Environ Toxicol Chem 30:682-691 Brodeur JC, Melpel S, Anglesio AB, Cristos D, D'Andrea MA, Poliserpi MB (2016) Toxicities of glyphosate- and cypermethrin-based pesticides are antagonic in the tenspotted livebearer fish (Cnesterodon decemmaculatus). Chemosphere 155:429-435

97

Brodeur JC, Poliserpi MB, D'Andrea MF, Sanchez M (2014) Synergy between glyphosate- and cypermethrin-based pesticides during acute exposures in tadpoles of the common South American Toad Rhinella arenarum. Chemosphere 112:70-76 Brodeur JC, Sassone A, Hermida GN, Codugnello N (2013) Environmentally-relevant concentrations of atrazine induce non-monotonic acceleration of developmental rate and increased size at metamorphosis in Rhinella arenarum tadpoles. Ecotoxicol Environ Saf 92:10 17 Brooks TM et al. (2016) Analysing biodiversity and conservation knowledge products to support regional environmental assessments. Sci Data 3:160007 Brühl CA, Pieper S, Weber B (2011) Amphibians at risk? Susceptibility of terrestrial amphibian life stages to pesticides. Environ Toxicol Chem 30:2465-2472 Burlibasa L, Gavrila L (2011) Amphibians as model organisms for study environmental genotoxicity. Appl. Ecol Environ Res 9:1-15 Calabrese EJ (1995) Toxicological consequences of multiple chemical interactions: a primer. Toxicology 105:121-135 Calamari D, Alabaster JS (1980) An approach to theoretical models in evaluating the effects of mixtures of toxicants in the aquatic environment. Chemosphere 9:533-538 CASAFE (2013) Guía de Productos Fitosanitarios para la República Argentina. Cámara de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes, Buenos Aires Ç v ş T Kon n S (2007) D t t on o yto n t n DNA m n p rp r l erythrocytes of goldfish (Carassius auratus) exposed to a glyphosate formulation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis 22:263-268 Egea-Serrano A, Relyea RA, Tejedo M, Torralva M (2012) Understanding of the impact of chemicals on amphibians: A meta-analytic review. Ecol Evol 2:1382-1397 Feng S, Kong Z, Wang X, Zhao L, Peng P (2004) Acute toxicity and genotoxicity of two novel pesticides on amphibian, Rana N. Hallowell. Chemosphere 56:457-463 Ficetola GF, Maiorano L (2016) Contrasting effects of temperature and precipitation change on amphibian phenology, abundance and performance. Oecologia 181:683-693 Finney DJ (1971) Probit Analysis. Cambridge Univ. Press. , London Furlong ET, Anderson BD, Werner SL, Soliven PP, Coffey LJ, Burkhardt MR (2011) Methods of analysis but the US Geological Survey National Water Quality Laboratory – Determination of Pesticides in Water by Graphitized Carbon-based Solid-Phase Extraction and High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. US Geological Survey Water Resources Investigations Report 01-4134:73 Ge H, Lin Z, Yao Z, Gao Z, Cong Y, Yu H (2014) Balance between herbicidal activity and toxicity effect: a case study of the joint effects of triazine and phenylurea herbicides on Selenastrum capricornutum and Photobacterium phosphoreum. Aquat Toxicol 150:165-174 98

Gosner KL (1960) A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica 16:183-190 Grisolia CK, Bilich MR, Formigli LM (2004) A comparative toxicologic and genotoxic study of the herbicide arsenal, its active ingredient imazapyr, and the surfactant nonylphenol ethoxylate. Ecotoxicol Environ Saf 59:123-126 Ippolito A, Kattwinkel M, Rasmussen JJ, Schafer RB, Fornaroli R, Liess M (2015) Modeling global distribution of agricultural insecticides in surface waters. Environ Pollut 198:54-60 Jones DK, Hammond J, Relyea RA (2010) Roundup® and amphibians: the importance of concentration, application time, and stratification. Environ Toxicol Chem 29:20162025 Jones DK, Hammond JI, Relyea RA (2009) Very highly toxic effects of endosulfan across nine species of tadpoles: lag effects and family-level sensitivity. Environ Toxicol Chem 28:1939-1945 Kehoe L, Kuemmerle T, Meyer C, Levers C, Václavík T, Kreft H (2015) Global patterns of agricultural land-use intensity and vertebrate diversity. Divers Distrib 21:1308-1318 Kwet A, Reichle S, Silvano D, Úbeda C, Baldo D, Di Tada I (2004) Rhinella arenarum. The International Union for Conservation of Nature List of Threatened Species 2004: eT54576A11169255 Larramendy ML (2017a) Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-traditional Aquatic Models. The Royal Society of Chemistry, Cambridge Larramendy ML (2017b) Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-traditional Terrestrial Models. The Royal Society of Chemistry, Cambridge LeBlanc GA, Wang G (2006) Chemical Mixtures: Greater-than-Additive Effects? Environ Health Perspec 114:A517–A518 Liang HC, Razaviarani V, Buchanan I (2013) Pesticides and herbicides. Water Environ Res 85:1601-1645 Liaud C et al. (2016) Utilization of long duration high-volume sampling coupled to SPME-GC-MS/MS for the assessment of airborne pesticides variability in an urban area (Strasbourg, France) during agricultural applications. J Environ Sci Health 0:1-12 Lydy M, Belden J, Wheelock C, Hammock B, Denton D (2004) Chanllenges in regulating pesticide mixtures. Ecol Soc 9:1-13 Mann RM, Bidwell JR (1999) The toxicity of glyphosate and several glyphosate formulations to four species of southwestern Australian frogs. Arch Environ Contam Toxicol 36:193-199 Mann RM, Hyne RV, Choung CB, Wilson SP (2009) Amphibians and agricultural chemicals: review of the risks in a complex environment. Environ Pollut 157:2903-2927 99

Maselli V, Polese G, Rippa D, Ligrone R, Rastogi RK, Fulgione D (2010) Frogs, sentinels of DNA damage induced by pollution in Naples and the neighbouring Provinces. Ecotoxicol Environ Saf 73:1525-1529 Mazzatorta P, Benefenati E, Neagu D, Gini G (2002) The importance of scaling in data mining for toxicity prediction. J Chem Informat Model 42:1250-1255 Meffe R, de Bustamante I (2014) Emerging organic contaminants in surface water and groundwater: A first overview of the situation in Italy. Sci Total Environ 481:280-295 Meza-Joya FL, Ramírez-Pinilla MP, Fuentes-Lorenzo JL (2013) Toxic, cytotoxic, and genotoxic effects of a glyphosate formulation (Roundup®SL-Cosmoflux®411F) in the direct-developing frog Eleutherodactylus johnstonei. Environ Mol Mutagen 54:362-373 Mouchet F, Baudrimont M, Gonzalez P, Cuenot Y, Bourdineaud JP, Boudou A, Gauthier L (2006a) Genotoxic and stress inductive potential of cadmium in Xenopus laevis larvae. Aquat Toxicol 78:157-166 Mouchet F, Gauthier L, Baudrimont M, Gonzalez P, Mailhes C, Ferrier V, Devaux A (2007) Comparative evaluation of the toxicity and genotoxicity of cadmium in amphibian larvae (Xenopus laevis and Pleurodeles waltl) using the comet assay and the micronucleus test. Environ Toxicol 22:422-435 Mouchet F, Gauthier L, Mailhes C, Ferrier V, Devaux A (2006b) Comparative evaluation of genotoxicity of captan in amphibian larvae (Xenopus laevis and Pleurodeles waltl) using the comet assay and the micronucleus test. Environ Toxicol 21:264-277 Nikoloff N, Larramendy ML, Soloneski S (2014a) Comparative evaluation of the in vitro micronucleus and comet assay for evaluation of fluorochloridone-induced genotoxicity. Environ Toxicol 29:884-892 Nikoloff N, Natale GS, Marino D, Soloneski S, Larramendy ML (2014b) Flurochloridone-based herbicides induced genotoxicity effects on Rhinella arenarum tadpoles (Anura: Bufonidae). Ecotoxicol Environ Saf 100:275-281 Olszyk D, Pfleeger T, Lee EH, Plocher M (2015) Glyphosate and dicamba herbicide tank mixture effects on native plant and non-genetically engineered soybean seedlings. Ecotoxicology 24:1014-1027 Pérez-Iglesias JM, de Arcaute CR, Natale GS, Soloneski S, Larramendy ML (2017) Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicol Environ Saf 142:503-508 Pérez-Iglesias JM, Ruiz de Arcaute C, Nikoloff N, Dury L, Soloneski S, Natale GS, Larramendy M (2014) The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicol Environ Saf 104:120-126

100

Pérez-Iglesias JM, Soloneski S, Nikoloff N, Natale GSL, M L (2015) Toxic and genotoxic effects of the imazethapyr-based herbicide formulation Pivot H® on montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicol Environ Saf 119:15-24 Pimentel D et al. (1993) Environmental and economic effects of reducing pesticide use in agriculture. Agric Ecosys Environ 46:273-288 Pitarque M, Creus A, Marcos R, Hughes AA, Anderson D (1999) Examination of various biomarkers measuring genotoxic endpoints from Barcelona airport personnel. Mutat Res 440:195-204 Ralph S, Petras M (1998) Caged amphibian tadpoles and in situ genotoxicity monitoring of aquatic environments with the alkaline single cell gel electrophoresis (comet) assay. Mutat Res 413:235-250 Rodney SI, Teed RS, Moore DRJ (2013) Estimating the toxicity of pesticide mixtures to aquatic organisms: A review. Hum Ecol Risk Assess 19:1557-1575 Ruiz de Arcaute C, Pérez-Iglesias JM, Nikoloff N, Natale GS, Soloneski S, Larramendy M (2014) Genotoxicity evaluation of the insecticide imidacloprid on circulating blood cells of Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae) by comet and micronucleus bioassays. Ecol Indic 45:632-639 Santos MJ, Morgado R, Ferreira NG, Soares AM, Loureiro S (2011) Evaluation of the joint effect of glyphosate and dimethoate using a small-scale terrestrial ecosystem. Ecotoxicol Environ Saf 74:1994-2001 SENASA (2013) Argentinean National Service for Sanitary and Quality of Agriculture and Food. http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=1506&io=18122 Silva AR, Cardoso DN, Cruz A, Lourenco J, Mendo S, Soares AM, Loureiro S (2015) Ecotoxicity and genotoxicity of a binary combination of triclosan and carbendizim to Daphnia magna. Ecotoxicol Environ Saf 115:279-290 Singh NP (1996) Microgel electrophoresis of DNA from individual cells: principles and methodology. In: Pfeifer GP (ed) Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations. Plenum Press, New York, pp 3-24 Soloneski S, González NV, Reigosa MA, Larramendy ML (2007) Herbicide 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)-induced cytogenetic damage in human lymphocytes in vitro in presence of erythrocytes. Cell Biol Internat 31:1316-1322 Soloneski S, Larramendy ML (2010) Sister chromatid exchanges and chromosomal aberrations in Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells treated with insecticide pirimicarb. J Hazard Mater 174:410-415 Soloneski S, Ruiz de Arcaute C, Larramendy ML (2016) Genotoxic effect of a binary mixture of dicamba- and glyphosate-based commercial herbicide formulations on Rhinella arenarum (Hensel, 1867) (Anura, Bufonidae) late-stage larvae. Environ Sci Pollut Res 23:17811-17821 101

Sparling DW, Fellers GM (2009) Toxicity of two insecticides to California, USA, anurans and its relevance to declining amphibian populations. Environ Toxicol Chem 28:1696-1703 Svartz GV, Aronzon CM, Perez Coll CS (2016) Combined endosulfan and cypermethrin-induced toxicity to embryo-larval development of Rhinella arenarum. J Toxicol Environ Health A: 79:197-209 Tatum VL, Borton DL, Streblow WR, Louch J, Shepard JP (2012) Acute toxicity of commonly used forestry herbicide mixtures to Ceriodaphnia dubia and Pimephales promelas. Environ Toxicol 27:671-684 UN (2011) Peligros para el medio ambiente. Naciones Unidas Parte 4:229-258 USEPA (1975) United States Environmental Protection Agency. Methods for acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates, and amphibians. US Government Printing Office, Washington, DC 660/3-75-009:62 USEPA (1982) United States Environmental Protection Agency. Pesticide Assessment Guidelines Subdivision E. Hazard evaluation: wildlife and aquatic organisms US Government Printing Office, Washington, DC EPA-540/9-82-024 USEPA (2002) United States Environmental Protection Agency. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms. Fifth edition US Government Printing Office, Washington, DC 821-R-02012 USEPA (2017) United States Environmental Protection Agency. Pesticide science and assessing pesticide risks. Technical overview. Ecological risk assessment. https://www.epa.gov/pesticide-science-and-assessing-pesticide-risks/technicaloverview-ecological-risk-assessment-0#Ecotox US Government Printing Office, Washington, DC Varona-Uribe ME et al. (2016) Exposure to pesticide mixtures and DNA damage among rice field workers. Arch Environ Occupat Health 71:3-9 Vera-Candioti J, Natale GS, Soloneski S, Ronco AE, Larramendy ML (2010) Sublethal and lethal effects on Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles exerted by the pirimicarb-containing technical formulation insecticide Aficida®. Chemosphere 78:249255 Wagner N, Lötters S, Veith M, Viertel B (2015) Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere 135:175-181 Wagner N, Züghart W, Mingo V, Lötters S (2014) Are deformation rates of anuran developmental stages suitable indicators for environmental pollution? Possibilities and limitations. Ecol Indic 45:394-401 Warne MSJ (2003) A review of the ecotoxicity of mixtures, approaches to, and recommendations for their management. In: A. Langley, M. Gilbey, B. Kennedy, Eds.), 102

Proceedings of the Fifth National Workshop on the Assessment of Site Contamination. National Environment Protection Council Service Corporation, Adelaide, Australia Wu J, Gao T, Xu HG, Cui P, Chen L, Dind H (2013) Methods for monitoring of amphibians and monitoring programmes in foreign countries. J Ecol Rural Environ 29:784-788 Yin XH, Li SN, Zhang L, Zhu GN, Zhuang HS (2008) Evaluation of DNA damage in Chinese toad (Bufo bufo gargarizans) after in vivo exposure to sublethal concentrations of four herbicides using the comet assay. Ecotoxicology 17:280-286

103

CAPÍTULO IV

Acute lethality and genotoxicity assessment of four herbicides, alone and in binary mixtures, towards Cnesterodon decemmaculatus (pisces, poeciliidae)

Wanessa Fernandes Carvalho 1,2,3

1

1,3

; Celeste Ruiz de Arcaute4,5; Daniela de Melo e Silva

; Sonia Soloneski 4,5 e Marcelo L. Larramendy 4,5

Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Federal de Goiás,

Goiânia, Goiás, Brasil. 2

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal

de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 3

Laboratório de Mutagênese e Radiobiologia, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil. 4

Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional

de La Plata, Calle 64 Nº 3, B1904AMA La Plata, Argentina. 5

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina.

104

ABSTRACT

Acute toxicity of the herbicides and their binary combinations were analyzed in the fish species Cnesterodon decemmaculatus. The lethal and sublethal effects were determined according to mortality tests and by the single cell gel electrophoresis (SCGE) bioassay. The LC5096h value for Herbifen Super® was 2.668 mg / L, Weedar Full® was 678.04 mg / L, Dedalo elite® was 0.463 mg / L and for Credit® was 91.73 mg / L based on 2.4 D-ester, 2,4-D-amine, 2,4-D-acid and glyphosate respectively. We also found an increase in the genetic damage index (GDI) and the percentage of damaged cells in erythrocytes of Cnesterodon decemmaculatus exposed to Herbifen Super®, Weedar Full®, Dedalo elite® and Credit® in 5% and 10%. The herbicides tested showed different behaviors when combined at 5% and 10% of LC5096h. The toxic effects of the combination of Herbifen Super® and Credit® were basically due to the action of glyphosate present in Credit®. We finally verified a synergism among Weedar Full® and Dedalo elite®. Thus, this study is pioneer in the evaluation of the induction of acute effects of lethality and subletality of binary combinations of Herbifen Super®, Weedar Full®, Dedalo elite® and Credit® in adults of Cnesterodon decemmaculatus.

Keywords: Herbicides mixtures; comet assay; lethal; sublethal; fishes.

105

1.

INTRODUCTION

Pesticides are manufactured compounds used in agriculture to prevent or reduce the adverse effects of pests (Hoshi, 2009). The use of these compounds in many South American countries has increased due to the conversion of small properties to large monocultures and due to the continuous appearance of weeds tolerant or resistant to the mechanisms of action of herbicides and to the different types of cultivation systems (Dirzo and Raven, 2003). Roundup® is a pesticide belonging to the group of organophosphates and has glyphosate (N-phosphonomethyl glycine) as the active ingredient. Glyphosate is a weak organic acid, formed by one molecule of glycine (carbonyl + amine) and another of phosphonomethyl, which results in different ionic charges as a function of the pH of the medium and is soluble in water (Mensink & Janssen, 1994). Most organophosphorus compounds are less stable than organochlorine compounds and are rapidly broken down by chemical or biochemical reactions, presenting half-lives when released into the environment, and their environmental damage is largely related to acute toxicity (Walker et al., 2006). Organophosphates, even in insufficient concentrations, can alter the cellular processes of the affected organisms (Silva et al., 2013). 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid is a low molecular weight organic acid, a member of the chlorophenoxyacetic herbicide family and classified by the National Sanitary Surveillance Agency (Anvisa) as a hormonal herbicide of the phenoxyacetic group (Anvisa, 2016). It is an auxinic herbicide of systemic and selective action, presents a broad spectrum of pest control and low environmental persistence (Mithila et al., 2011, EPA, 2006). It is a weak acid generally applied in pre-planting (or presowing) for desiccation or in post emergence in cereal crops (Rodrigues; Almeida, 2011). 2.4-D and glyphosate are applied post-emergence in large-scale crops and play an important role in the optimization of agricultural production worldwide and both have hydrophilic characteristics (Mithila et al., 2011, Denis et al., 2006). The complexity of the chemical interactions between pesticides and the indiscriminate use of mixtures induce changes in the physicochemical properties and behavior of the molecules and can cause impacts on the environment and human health (Guimarães,

106

2014; Figueiredo, 2015). Solvents used in commercial formulations may alter the toxicological properties of the product, and some surfactants may present important irritant actions, not being an action of the active principle itself (Itho, 2014). Aquatic biota are often exposed to toxic substances from industrial, domestic and agricultural wastes that have brought genetic and toxicological damage to aquatic life (Van Der Oost et al., 2003). Toxic agents are hazardous to the environment due to their persistence, bioaccumulation and toxicity, are capable of disrupting the organic balance and may cause changes in the body's homeostasis (Larini, 1993; Souza, 2008). The biological communities of the aquatic environment reflect the physical, chemical and biological integrity of these ecosystems, thus, biological monitoring is a useful tool in the evaluation of the responses of these communities to changes in environmental conditions (Van Der Oost et al., 2003; Lacerda, 2005). Most toxic substances are capable of interacting with living organisms causing multiple changes that can have serious consequences on individuals, populations, communities or ecosystems, depending on the degree of contamination and the time of exposure (Prattesantos et al., 2008). Fishes

can

concentrate

environmental

pollutants

and

are

excellent

bioindicators in toxicity studies, since they detect early the presence of toxic agents, even at low concentrations in aquatic ecosystems (Vignardi, 2012). The use of fishes as bioindicators of the effects of pollutants in the aquatic environment has shown satisfactory results in bioassays that evaluate potentially teratogenic and carcinogenic chemicals for man and usually respond to toxic compounds in pathways similar to large vertebrates (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Matsumoto & Cólus, 2000; Grisolia, 2009). In order to evaluate the toxicity of pesticides in fish and other organisms, the comet assay has been applied using erythrocytes due to the sensitivity of the blood cells to the genotoxic effects of various substances (Souza and Fontanetti, 2007). One fish species used in

genotoxicity trials is the

Cnesterodon

decemmaculatus (Jenyns, 1842), which is a small poecilide, up to 5 cm in length, with omnivorous habits and feeds primarily on zooplankton, insect larvae and algae, and is commonly known in Argentina as "Madrecita". Its distribution covers most of the Rio de La Plata and the Atlantic basin in Argentina, Brazil and Uruguay (Rosa & Costa, 1993). This species is tolerant to the physicochemical variations of the water, so it is

107

common to find it in altered environments (Bistoni et al., 1999, Hued & Bistoni, and Teixeira de Mello, 2007). Some studies have shown that C. decemmaculatus is a bioindicator of environmental quality in assessing the lethal and sub-lethal effects of various pesticides, as pirimicarb (Vera-Candioti et al., 2010, 2013c, 2015), endosulfan (Mugni et al., 2012b), cypermethrin (Carriquiriborde et al., 2007; Mugni et al., 2012b), glyphosate (Carriquiriborde et al., 1998) and Candamba (Ruiz de Arcaute, et al., 2014). Therefore, the objective of the present study was to evaluate the effects and interactions of the herbicides Glyphosate and 2,4-D (salt, ester and amine) on native C. decemmaculatus, exposed under laboratory conditions, using the comet assay.

2. MATERIAL AND METHODS 2.1. Chemicals The agrochemicals used in this study included the commercial formulation based on Herbifen Super® (97% butyl ester of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, CAS 9480-4 or 1713-15-1 or their mixtures), Weedar Full® (83.5% mixture of salts of 2,4dichlorophenoxyacetic

acid,

CAS

2008-39-1),

Dedalo

elite

(30%

2,4-

dichlorophenoxyacetic acid, CAS 94-75-7) and 48% isopropylamine salt [N(phosphonomethyl) glycine, based on glyphosate, CAS1071-83-6), commercial formulation of Credit® (Dow AgroSciences Argentina SA). Cyclophosphamide (CP; CAS 6055-19-2) was purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO).

2.2. Quality control The analyte levels of each herbicide were estimated by high performance liquid chromatography using an ultraviolet detector and fluorenyl methyl oxy carbonyl derivatization. The concentration levels of the 2,4-D (ester, amine and acid) and glyphosate were analyzed by the QV Chem Laboratory (La Plata, Buenos Aires, Argentina) according to US Geological Survey Report 01-4134 (Furlong et al., 2011) and by OSHA Analytical Method PV2067, respectively. Pure substance samples from test solutions correspond to values obtained immediately after preparation (0 h) and at 24 h. The detection limit was 0.5 mg L-1 for 2,4-D and 0.2 mg L-1 for GLY.

108

2.3. Test organisms The individuals of C.decemmaculatus were collected in permanent lakes, outside agricultural areas, in the vicinity of the city of La Plata (Buenos Aires, Province of Argentina). The subjects were treated according to SENASA (Argentine National Service of Sanitary and Quality of Agriculture and Food) 617/2002 for biological testing (SENASA, 2013). The fish were transported to the laboratory and acclimatized for 20 days, at 16 / 8h light / dark cycle. Until the beginning of the experiment, they were fed with artificial aeration and an ad libitum daily supply of commercially available fish food (TetraMins, TetraWerke, Melle, Germany). 2.4. Determination of LC50 The toxicity assessment was performed for each experimental point, and ten individuals were randomly selected and kept in a 1L glass vessel, according to the recommendations proposed by the standard EPA methods in the USA for acute tests of toxicity ((IRAM, 2008; USEPA, 1975, 2002), with slight modifications (Mugni et al., 2016; Ruiz de Arcaute et al., 2014; Vera-Candioti et al., 2010, 2013a, 2013b, 2013c, 2015). To determine the concentrations used in the acute toxicity tests, the preliminary tests were performed according to the recommendations proposed by U.S. Environmental Protection Agency (USEPA 2002). The organisms were exposed for 96 hours to twelve concentrations of Herbifen Super® (1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 12 and 15 mg/L 2,4-D) or to nine concentrations of Dedalo elite (0.1, 0.2, 0.25, 0.35, 0.45, 0.55, 0.60, 0.65 and 1 mg/L 2,4-D). Negative control (dechlorinated tap water, pH 7.5570.1, dissolved oxygen, 6.370.3 mg / L, NH4 ≤0.2 mg/L, 143723.5 mg CaCO3 / L) and a positive control (40 mg / L cyclophosphamide) were run and performed simulteaneoulsy with herbicide-exposed fish as suggested elsewhere (Vera-Candioti et al., 2013c). All test solutions were prepared before use and replaced after 24 hours. The experiments were performed in triplicate and the fish were not fed during the 96 hours of exposure. Mortality was assessed by visual observation every 24 hours. Individuals were considered dead when no movement was detected.

2.5. Single Cell Gel Electrophoresis Assay (SCGE)

109

The SCGE assay was performed following the alkaline procedure described by Singh (1996) with sligth modifications. The experiment was carried out with five adult individuals of C. decemmaculatus kept in 1L glass containers and exposed to two concentrations of the tested herbicides, equivalent to 5% and 10% of LC50, during 96h, corresponding to the pesticides alone or in mixtures. Fishes were euthanized and peripheral blood samples were collected from each individual. Samples were diluted in 1mL of phosphate buffered saline, centrifuged at 2000 rpm for 7 min, and resuspended in a final volume of 40 μl of phosphate buffered saline. 40μl of the diluted samples were mixed with 60μl of 0.5% low melting agarose and then placed on precoated slides with 100μl of 1.0% agarose with normal melting point. The slides were covered with coverslips and placed at 4 ° C for five minutes. After solidification, the coverslips were removed and the slides were immersed in lysis solution (1% sodium sarcosinate, 2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10.0, Triton X- 100 to 1%, 10% DMSO). The slides remained in the lysis solution for a period of 1 h at 4ºC in the dark and then placed in an electrophoresis buffer (1 mM Na 2 EDTA, 300 mM NaOH) for 15 min at 4ºC to allow DNA denaturation, followed by electrophoresis in the same buffer for 10 min at 25V and 250mA. The slides were neutralized with a solution comprising 0.4 M Tris-HCl, pH 7.5, stained with 4 ', 6diamino-2-phenylindole (DAPI; Vectashield H1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). The slides were examined under an Olympus BX50 fluorescence photomicroscope. The extent of DNA damage was quantified by the length of the DNA migration, which was determined visually on 100 randomly selected non-accumulated cells. DNA damage was classified into five classes (0 - I, undamaged, II, minimal damage, III, average damage, IV, maximum damage) (Cavas and Konen 2007). Data were expressed as the mean number of damaged cells (sum of classes II, III and IV) and the mean comet score for each treatment group. The genetic damage index (GDI) was calculated for each test compound following Pitarque et al. (1999) using the formula GDI = [I (I) + 2 (II) + 3 (III) + 4 (IV) / N (O-IV)], in which 0 - IV represents the nucleoid type and N0- NIV represents the total number of nucleoids.

2.6. Statistical analysis Fish lethality data were estimated according to the Probit method (http://www.epa.gov/nerleerd/stat2.htm.) (Finney, 1971). The unidirectional ANOVA 110

with the Dunnett test was performed to analyze DNA damage data, aiming to determine differences between the exposed and control groups. For all tests, the significance criterion was 0.05. The analysis software was Statistica 7.0.

3. RESULTS 3.1. Chemical analysis 3.2. Mortality According to the Probit method, the Herbifen Super® LC50 values were determined after 24, 48, 72 and 96 hours of exposure. The results showed value of LC50 24 h = 6.122 mg / L (range, 5.0617-6.7114), LC50 48h = 3.669 mg / L (range, 3.442 -3.863), LC50 72h = 3.040 mg / L (range, 2.823-3.225), and LC50 96h = 2.668 mg / l (range, 2.482-2.823). Mortality experiments revealed the LC50 values of the 2,4-D present within the based formulation Dedalo elite of 0.846 mg / L (range, 0.778-0.954), 0.646 mg / L (range, 0.611-0.693), 0.513 mg / L (0.469-0.562) and 0.463 mg / L (range, 0.420-0.511) after 24, 48, 72, and 96 h of exposure, respectively. Mortality experiments revealed the LC50 values of the 2,4-D present within the based formulation Weedar® Full of 1,203.29 mg L-1 (range, 1,145.79–1,254.03 mg L1), 919.81 mg L-1 (range, 771.11–1371.89 mg L-1), 756.82 mg L-1 (range, 716.73– 802.62 mg/L), and 678.04 mg L-1 (range, 639.35–718.04 mg L-1) after 24, 48, 72, and 96 h of exposure, respectively. Acute toxic effects of the Credit® formulation on C. decemmaculatus was reported previously by Vera-Candioti et al. (2013). Mortality experiments revealed the LC50 values for the GLY contained in the Credit® formulation of 98.50 mg/L (range, 93.60–105.80 mg L-1), 93.73 mg L-1 (range, 89.10–100.20 mg L-1), 91.73 mg L-1 (range, 86.80–98.00 mg L-1), and 91.73 mg L-1 (range, 86.80–98.00 mg L-1) after 24, 48, 72, and 96 h of exposure, respectively. 3.3. DNA damage The results of the SCGE assay obtained for percentage of damaged nucleoids in C. decemmaculatus after 96 hours of exposure to Credit® (Gly), Herbifen Super® (2,4-D ester and mixtures), Weedar Full® (2,4-D amine and mixtures) and Dedalo Elite® (2,4-D

111

acid and mixtures) are shown in Table 1 and the genetic damage index are shown in Figure 1. The positive control induced an approximately six-fold increase in the frequency of damaged cells in compared to the negative control (P <0.001). This alteration was probably due to the increase in nucleoid frequencies types II, III and IV and a decrease of nucleoids type 0-I (P <0.001). For the percentage of damaged cells, there were differences between the treatments with 5% and 10% of ester (P = 0.0018, F = 6.04), amine (P = 0.0004, F = 7.8) and acid (P = 0.000, F = 24.48). In addition, there were significant differences between 10% amine and the 10% Gly + 2,4-D amine mixture (P = 0.00002; F = 12.626). Differences were also observed between treatments containing 5% Gly and 5% ester (P = 0.0018, F = 6.04) and the 5% Gly + 2,4-D ester mixture (P = 0.0188; F = 3.85). 10% glyphosate showed differences between the frequencies of cells damaged with 10% 2,4-D amine (P = 0.02, F = 3.54) and with the 2,4-D 10% acid (P = 0.00013; F = 9,594). For the genomic damage index (GDI) [Figure XX], there were differences between treatments 5% glyphosate with the mixture of Gly + 2,4-D ester at 5% (P = 0.01, F = 4.04), with 5% 2,4-D ester (P = 0.002, F = 5.711), with 2,4-D amine (P = 0.047, F = 3.019) and with 2,4-D acid at 5% (P = 0.00039; F = 3.158). There was an increase of type III cells with 5% glyphosate compared to 5% 2,4-D ester (P = 0.018, F = 3,768) and type IV cells with 5% glyphosate compared to 5% 2,4-D amine (P = 0.032, F = 3.305). We also found differences between 10% glyphosate compared to exposure to 10% 2,4-D amine (P = 0.002, F = 5.517), to 10% acid 2,4-D (P = 0.000931, F = 6.838) and finally, with gliphosate associated to 10% acid 2,4-D (P=0.002; F=5.792), being such difference caused by an increase in nucleoids type IV (P=0.002; F=5.517; F=5.792), in the treatments with 10% 2,4-D amine and acid 10% Gly+2,4-D and type III (P=0.015; F=3.936) and IV (P=0.008; F=4.425) nucleoids in the 10% 2,4-D acid treatment. Among the 5 and 10% ester groups, significant differences in GDI values (P = 0.001; F = 6.68) were also found, due to the high frequencies of nucleoids types III (P = 0.0003, F = 8.555) and IV (P = 0.01; F = 4.238) in animals treated with 10% 2,4-D ester. In the amine group, the 5% 2,4-D amine showed differences in the GDI values compared to the 10% 2,4-D amine (P = 0.000006; F = 15.886), due to the increase of type II (P = 0.030, F = 3.55); III (P = 0.012, F = 4.080) and IV (P = 0.0004, F = 7.724)

112

nucleoids. In addition, differences between 5% 2,4-D amine GDI and 5% Gly + 2,4-D amine (P = 0.018; F = 3.85) were detected, although we do not find significant differences between the frequencies of type II, III and IV nucleoids between these treatments. The 10% 2,4-D amine was different for the GDI values compared to glyphosate associated with 10% amine (P = 0.0001; F = 9.594), due to an increase of type III (P = 0.0001 F = 9.132) and IV (p = 0.008, F = 6.955) nucleoids in the mixture. In the acid agrochemical, there were significant differences between 5% and 10% (P = 0.00001; F = 22,651) concentratios, due to the increase of types II (P = 0.0009, F = 4.316), III (P = 0.0001; F = 8,891) and IV (P = 0.00002; F = 12.560) nucleoids in the highest concentration. Contrasting 10% acid 2,4-D to acid Gly + 2,4-D at 10% we also observed a significant increase of damage (P = 0.00000: F = 39.61) due to the high frequency of types III (P = 0.008, F = 4.412) and IV (P = 0.00005; F = 22.885)nucleoids.

113

Table 1. Analysis of DNA damage measured by comet assay in peripheral blood erythrocytes of Cnesterodon decemmaculatus cells exposed to GLY and 2,4-D (éster, acid amine and mixtures). Number of animals observed

Number of cells analyzed

Negative control Positive controlb

15 15

GLY 5% 10%

Chemicals (LC5096h)

Nucleoids Categories % ± SE

% of damaged cells (II+III+IV)

1601 1647

Type 0+I 86.45 ± 1.95 21.43 ± 3.24

Type II 10.37 ± 1.05 23.38 ± 2.74

Type III 2.19 ± 0.73 21.74 ± 1.69

Type IV 13.55 ± 1.38 33.45 ± 3.29

13.35 ± 1.38 78.57 ± 2.99***

15 15

1571 1558

41.82 ± 5.94 30.81 ± 4.64

22.92 ± 1.41 26.06 ± 1.52

18.71 ± 1.4 21.25 ± 1.30

16.55 ± 1.68 21.89 ± 1.45

58.18 ± 1.63*** 69.19 ± 1.51***

2,4D éster and mixtures 5% 10% 5% GLY+5% 2,4-D 10% GLY+10% 2,4-D

15 15 15 15

1663 1597 1681 1572

47.62 33.94 33.29 27.48

± ± ± ±

8.02 4.95 4.97 3.87

25.56 25.55 30.28 25.95

± ± ± ±

2.08 1.40 2.76 1.11

15.39 19.16 20.76 21.31

± ± ± ±

2.82 1.01 2.06 0.93

11.43 21.35 17.67 25.25

± ± ± ±

2.30 1.32 3.76 1.15

52.38 66.06 68.71 72.52

± ± ± ±

2.93*** 1.43*** 2.28*** 1.18***

2,4D amina and mixtures 5% 10% 5% GLY+5% 2,4-D 10% GLY+10% 2,4-D

15 15 13 15

1576 1590 1365 1599

31.98 37.52 31.36 23.89

± ± ± ±

4.55 5.94 4.88 3.45

31.92 15.35 25.05 16.89

± ± ± ±

2.17 1.75 1.60 1.20

18.85 18.07 19.56 23.14

± ± ± ±

1.01 2.10 1.14 0.69

17.26 29.06 24.03 36.09

± ± ± ±

0.85 2.87 2.02 1.09

68.02 62.48 68.64 76.11

± ± ± ±

2.05*** 2.77*** 1.73*** 2.44***

2,4D dedalo and mixtures 5% 10% 5% GLY+5% 2,4-D 10% GLY+10% 2,4-D

15 15 15 15

1502 1570 1631 1600

41.88 34.71 32.43 30.69

± ± ± ±

5.41 4.80 4.89 4.87

22.90 16.82 21.77 14.81

± ± ± ±

0.73 1.49 1.74 1.38

17.44 17.32 16.19 18.75

± ± ± ±

1.39 1.47 0.96 1.30

17.78 31.15 29.61 35.75

± ± ± ±

1.56 1.09 2.04 3.84

58.12 65.29 67.57 69.31

± ± ± ±

1.41*** 2.25*** 2.24*** 3.50***

***=P<0.001

114

Figure 1. Analysis of genomic damage index (GDI) measured by comet assay in peripheral blood erythrocytes of Cnesterodon decemmaculatus cells exposed to GLY and 2,4-D (ester, acid amine and mixtures). NC = Negative control; PC = Positive control; * = different with Gly and mixture; # = distinct formulations of 2,4D and mixture; * = P<0.05; ** = P<0.01; *** = P<0.001.

4. DISCUSSION Our results demonstrated significant increases for GDI and percentage of damaged cells, regardless of active ingredient concentration, evidencing the genotoxic effect of herbicides individually or in combinations, to the species Cnesterodon decemmaculatus. The herbicides tested, containing 2,4-D as an active ingredient, revealed different behaviors when combined with Credit® (Gly) in their concentrations of 5% and 10% of the 96h LC50. Binary mixtures of Credit® (Gly) and Herbifen Super® (2,4-D ester and mixtures) demonstrated that the DNA damage index observed in GDI and the percentage of damaged cells in C. decemmaculatus erythrocytes was caused by the action of Credit® (Gly). Some studies have shown that the commercial basis of the GLY patent from Monsanto Agricultural Products Co (St. Louis, MI) is more toxic to aquatic organisms than the pure herbicide itself (Cedergreen and Streibig 2005; Peixoto 2005). A study by Pettersson and Ekelund (2006) indicated that GLY is less toxic to aquatic organisms. Carvalho et al. in press demonstrated that the concentration of 0.28 mg ai / L 115

of Glyphosate - Roundup Original® was sufficient to promote the increase of DNA damage in Dendropsophus minutus tadpoles. Additionally, we observed that Credit® (Gly) is more toxic than the 2,4-D ester for C. decemmaculatus. Such acute toxicity could be influenced by inert substances and mainly the surfactant (POEA), since this substance is cytotoxic and facilitates the herbicide absorption in tissues (Partearroya et al. al. 1991). Since

2000,

new

GLY-based

herbicides

have

been

launched

(http://www.pesticideinfo.org) and according to Teubal (2009), approximately 200 million GLYbased herbicides are used in Argentina to produce 50 million tons of soybeans per year. The International Agency for Research on Cancer (2015) evaluated the genotoxic potential of 2,4-D by in vivo and in vitro methods and found that this compound has the ability to induce DNA damage in different biotic matrices. Arcaute et al. (2016) demonstrated that 2,4-D could be considered a deleterious agent and present genotoxic effects to DNA for C. decemmaculatus. 2,4-D when released into the environment is absorbed by the gastrointestinal tract of aquatic organisms from 10 minutes to 24 hours after exposure (Knopp and Schiller, 1992). According to Correia and Moreira (2010), the toxic effects observed after exposure to 2,4-D were more severe than those observed for animals exposed to GLY at the same concentration. Herbicides at low concentrations are generally not toxic to aquatic organisms. Fonseca et al. (2008) reported that the presence of 2,4-D herbicide in the blood and brain of Leporinusn obtusidens compromises the activity of the enzyme acetylcholinesterase. Sarikaya and Yilmaz (2003) also described 2,4-D as highly toxic to fish, with severe effects on humans and animals (WHO, 1984). Our results demonstrated a synergism between the herbicides Weedar Full® (2,4D amine and mixtures) and Dedalo Elite® (2,4-D acid and mixtures) promoting increased DNA damage in C. decemmaculatus erythrocytes. Martínez-Tabche et al. (2004) found an increase of DNA breaks, after exposure to 2,4-D, in C. batrachus (Ateeq et al., 2005) and Oncorhynchus mikiss (Salmoniformes, Salmonidae) species. In this context, the auxin herbicides of acid and amine groups are more toxic to C. decemmaculatus than the group containing esters in their formulation. The rates of excretion of amine and acid substances are quite similar (Knopp and Schiller, 1992). According to Erne (1966) the absorption of 2,4-D ester was reported to be slower than 2,4-D acid and salt. Santos et al. (2011) also found a synergistic effect of binary combinations of GLY and dimethoate insecticide on Eisenia andrei invertebrates (Annelida, Lumbricidae), on Porcellionides pruinosus (Isopoda, Porcellionidae) and on Brassica rapa (Brassicales, Brassicaceae) seeds. In a study by Olszyk et al. (2015), it was demonstrated that the growth of the native soybean exposed 116

to the GLY and dicamba mixture might be lower for the development of the plant. Similar observations on mortality of late larvae of R. arenarum found significant synergistic effects for the equitoxic and unequidaxic mixtures of GLY and the commercial insecticidal formulations based on cypermethrin (Brodeur et al., 2014).

5. CONCLUSION Combinations of herbicides are widely used throughout the world to increase agricultural production and pest control, so the inappropriate use of these environmental contaminants in cultivated areas should receive increased attention by the competent authorities. Information on the concentrations of 2,4-D (ester, amine and acid) and glyphosate formulations alone or in combination with the environment is required to assess the risk of toxic substances to aquatic organisms.

6. ACKNOWLEDGEMENTS We thank the Sandwich Program (CAPES-PDSE-Edital nº 19/2016, Process: 88881.1350342016-01) and the National Council for Scientific and Technological Research (CONICET, PIP nº 0344) from Argentina. D.M.S and W.F.C. thanks CNPq and CAPES, respectively, for their scholarships.

7. REFERENCES Al-Sabti K, Metcalfe CD. Mutat Res. 1995 Jun;343(2-3):121-35. Review. PMID: 7791806. Ateeq, B., Abul Farah, M., Ahmad, W., 2005. Detection of DNA damage by alcaline single cell gel electrophoresis in 2,4-dichlorophenoxyacetic-acid- and butachlor- exposed erythrocytes of Clarias batrachus. Ecotoxicol. Environ. Saf. 62, 348–354. Anvisa - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Critérios para a classificação toxicológica. Disponívelem:. Acesso em: 03 fev. 2016. Bistoni M. A., A. Hued, M. Videla & L. Sagretti (1999). Water quality effects on fish communities of the central part of Argentina. Revista Chilena de Historia Natural 72:325-335. Brodeur Jc, Poliserpi Mb, D'andrea Mf, Sanchez M (2014) Synergy between glyphosate- and

117

cypermethrin-based pesticides during acute exposures in tadpoles of the common South American Toad Rhinella arenarum. Chemosphere 112:70-76. Carriquiriborde, P., Di´Az, J., Mugni, H., Bonetto, C., Ronco, A.E., 2007. Impact of cypermethrin on stream fish populations under field-use in biotech-soybean production. Chemosphere 68, 613–621. C v ş T. Kön n S. 2008. In vivo genotoxicity testing of the amnesic shellfish poison (domoic acid) in piscine erythrocytes using the micronucleus test and the comet assay. Aquat. Toxicol. 90, 154–159. C v ş T. 2011. In v vo notox ty v lu t on o tr z n n tr z n –based herbicide on fish Carassius auratus using the micronucleus test and the comet assay. Food Chem. Toxicol. 49, 1431–1435. C v ş T. 2013. In v vo notox ty v lu t on o tr z n n tr z n -based herbicide on fish Carassius auratus using the micronucleus test and the comet assay. Food Chem. Toxicol. 49, 1431–1435. Cedergreen, N., Streibig, J.C., 2005. The toxicity of herbicides to non-target aquatic plants and algae: assessment of predictive factors and hazard. Pest Manag. Sci. 61, 1152–1160. Correia, F.V. &Moreira, J. C. (2010). Effects of glyphosate and 2,4-D on earthworms (Eisenia fetida) in laboratory tests. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 85, 264– 268. De CASTILHOS GHISI, N., CESTARI, M.M., 2013. Genotoxic effects of the herbicide Roundup® in the fish Corydoras paleatus (Jenyns 1842) after short-term, environmentally low concentration exposure. Environ. Monit. Assess. 185, 3201–3207. Denis, M. H.; Delrot, S. Carrier-mediate uptake of glyphosate in broad bean (Vicia faba) via a phosphate transporter. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 87, p. 569-575, 2015. Dirzo, R. and Raven, P.H. (2003) Global state of biodiversity and loss. Annual Review of Environment and Resources, 28, 137-167. doi:10.1146/annurev.energy.28.050302.105532 Di Marzio,W.D., Alberdi, J.L., Sáenz, M.E., Tortorelli, M.D.C., 1998. Effects of paraquat (Osaquats formulation) on survival and total cholinesterase activity in male and female adults of Cnesterodon decemmaculatus (Pisces, Poeciliidae). Environ. Toxicol. Water Qual. 13, 55–59. Di Marzio, W.D., Tortorelli, M.C., 1994. Effects of paraquat on survival and total cholinesterase activity in fry of Cnesterodon decemmaculatus (Pisces, Poeciliidae). Bull. Environ. Contam. Toxicol. 52, 274–278. Erne, K. (1966). Di s t r i bution and elimination ofchlorinatedphenoxyacetic acids in animals. Acta VeterinariaScandinavica, 7, 240–256. Figueiredo, M.R.A. Interações entre os herbicidas 2,4-D e glifosato: aspectos químicos, bioquímicos e fisiológicos. 2015. 114 f. Dissertação (Mestrado em Ciências. Área de

118

concentração: Fitotecnia) - Es ol Sup r or São Paulo, Piracicaba, 2015.

A r ultur “Lu z

Qu roz” Universidade de

Fonseca, M. B., Glusczak, L., Moraes, B. S., Menezes, C. C., Pretto, A., Tierno, M. A., et al. (2008). The 2,4-D herbicide effects on acetylcholinesterase activity and metabolic parameters of piava freshwater fish (Leporinus obtusidens). Ecotoxicology and Environmental Safety, 69, 416– 420. Furlong E.T., Anderson B.D., Werner S.L., Soliven P.P., Coffey L.J., Burkhardt M.R., 2011. Methods of analysis but the US Geological Survey National Water Quality Laboratory – Determination of Pesticides in Water by Graphitized Carbonbased Solid-Phase Extraction and High-Performance Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry. US Geological Survey Water Resources Investigations Report 01-4134. pp. 73. Gonçalves, M.W., Marins de Campos, C.B., Batista, V.G., da Cruz, A.D., de Marco Junior, P., Bastos, R.P., de Melo E Silva, D., 2017. Genotoxic and mutagenic effects of Atrazine Atanor 50 SC on Dendropsophus minutus Peters, 1872 (Anura: Hylidae) developmental larval stages. Chemosphere 182, 730–737. Gholami-Seyedkolaei, S.J., Mirvaghefi, A., Farahmand, H., Kosari, A.A., Gholami- Seyedkolaei, S.J., Gholami-Seyedkolaei, S.J., 2013. Optimization of recovery patterns in common carp exposed to roundup® using response surface methodology: Evaluation of neurotoxicity and genotoxicity effects and biochemical parameters. Ecotoxicol. Environ. Saf. 98, 152–161. Guimarães, G. L. Principais fatores comerciais condicionantes da disponibilidade de produtos isolados e em misturas. In: Congresso Brasileiro Da Ciência Das Plantas Daninhas, 2014, Gramado. Palestra... Gramado: 2014. CD ROM. Grisolia CK, Bilich MR, Formigli LM (2004) A comparative toxicologic and genotoxic study of the herbicide arsenal, its active ingredient imazapyr, and the surfactant nonylphenol ethoxylate. Ecotoxicol Environ Saf 59:123-126. Hoshi L. Genotoxicidade em floricultores da região serrana do Rio de Janeiro: uso do teste de micronúcleo na mucosa oral; Genotoxicity in flower growers in the mountainous region of Rio de Janeiro: use of micronucleus test in oral mucosa.. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, FIOCRUZ, Rio de Janeiro. 2009. Hued, A. C. & Bistoni, M. A. 2005. Development and validation of a Biotic Index for evaluation of environmental quality in the central region of Argentina. Hydrobiologia 543:279-298. Itho, S. de F. Toxicologia. módulo XII: intoxicações por agrotóxicos. herbicidas Glifosato. Disponível em: Acesso em: 23 jun. 2014. Iram, 2008. Calidad ambiental-Calidad de agua. Determinación de la toxicidad letal aguda de sustancias en peces de agua dulce. Métodos semiestático. Insitituto Argentino de Normalización y Certificación, Buenos Aires, Argentina, p. 23. LarinI, L. Toxicologia. São Paulo: Editora Manole, 2ª Edição; 281p. 1993.

119

Martínez-Tabche, L., Madrigal-Bujaidar e Negrete, T., 2004. Genotoxicity and lipoperoxidation produced by paraquat and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in the gills of rainbow trout (Oncorhynchus mikiss). Bull. Environ. Contam. Toxicol. 73, 146–152. Knopp, D. & Schiller, F. Oral and dermal application of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid sodium and dimethylamine salts to male rats : investigations on absorption and excretion as well as induction of hepatic mixed-function oxidase activities. Archives Toxicology, 66 (3): 170-74. 1992. Matsumoto,F.E. e Colus,I.M.S.. Micronucleus frequencies in Astyanax bimaculatus (Characidae) treated with cyclophosphamide or vinblastine sulfate. Genet. Mol. Biol. [online]. 2000, vol.23, n.2, pp.489-492. ISSN 1415-4757. http://dx.doi.org/10.1590/S141547572000000200041. Menendez-Helman, R.J., Ferreyroa, G.V., Alfonso, M.D.S., Salibian, A., 2012. Glyphosate as an acetylcholinesterase inhibitor in Cnesterodon decemmaculatus. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 88, 6–9. Miguel Teubal, 2009. Agrarian Reform and Social Movements in the Age of Globalization Latin America at the Dawn of the Twenty-first Century Vol 36, Issue 4. Mithila, J. et al. Evolution of Resistance to Auxinic Herbicides: Historical Perspectives, Mechanisms of Resistance, and Implications for Broadleaf Weed Management in Agronomic Crops. Weed Science, v. 59, p. 445-457, 2011. Mensink, H. WHO Task Group on Environmental Health Criteria for Glyphosate, International Program on Chemical Safety, United Nations Environment Programme, International Labour Organisation, World Health Organization, 1994, ISBN 9241471594 177 páginas. Mohanty, G., Mohanty, J., Garnayak, S.K., Rath, S.K., Dutta, S.K., 2013. Use of comet assay in the study of DNA break in blood and gill cells of rohu (Labeo rohita) after an exposure to furadan, a carbamate pesticide. Res. J. Biotechnol. 8, 83–89. Mohanty, G., Mohanty, J., Nayak, A.K., Mohanty, S., Dutta, S.K., 2011. Application of comet assay in the study of DNA damage and recovery in rohu (Labeo rohita) fingerlings after an exposure to phorate, an organophosphate pesticide. Ecotoxicology 20, 283–292. Mugni, H., Demetrio, P., Paracampo, A., Pardi, M., Bulus, G., Bonetto, C., 2012a. Toxicity persistence in runoff water and soil in experimental soybean plots following chlorpyrifos application. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 89, 208–212. Mugni, H.A., Paracampo, A., Marrochi, N., Bonetto, C., 2012b. Cypermethrin, chlorpyrifos and endosulfan toxicity to two non-target freshwater organisms. Fresenius Environ. Bull. 21, 2085– 2089. Partearroya, M. A., Pilling, S. J., & Jones, M. N. (1991). The lysis of isolated fish (Oncorhynchus mykiss) gill epithelial- cells by surfactants. Comparative Biochemistry and Physiology. C, 100, 381–388

120

Pitarque, M., Vaglenov, A., Nosko, M., Hirvonen, A., Norppa, H., Creus, A., Marcos, R., 1999. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutat. Res. 441, 115–127. Olszyk D, Pfleeger T, Lee Eh, Plocher M, 2015. Glyphosate and dicamba herbicide tank mixture effects on native plant and non-genetically engineered soybean seedlings. Ecotoxicology 24:1014-1027 Peixoto, F., 2005. Comparative effects of the Roundup® and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere 61, 1115–1122. Pereira, J.L., Antunes, S.C., Castro, B.B., Marques, C.R., Gonc-alves, A.M.M., Gonc-alves, F., Pereira, R., 2009. Toxicity evaluation of three pesticides on non-target aquatic and soil organisms: commercial formulation versus active ingredient. Ecotoxicology 18, 455–463. Pettersson, M., Ekelund, N.G.A., 2006. Effects of the herbicides Roundup® and Avans on Euglena gracilis. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 50, 175–181. Rodrigues, B.N.; Almeida, F.S. Guia de herbicidas. 6a edição. Londrina: Edição dos autores, 2011. 697 p. Rosa, R. S. & W. J. E. M. Costa. 1993. Systematic revision of the genus Cnesterodon (Cyprinodontiformes, Poeciliidae) with the description of two new species from Brazil. Copeia, 1993: 696-708. S lv M. C v ş T. C ğl n K r su B nl A. Ko k M mm B. Ç nk l N., Dinçel, A. S., Vatan, O., Yilmaz, D., Sarikaya, R., Zorlu, T., Erkoç, F., 2013. Sublethal toxicity of esbiothrin relationship with total antioxidant status and in vivo genotoxicity assessment in fish (Cyprinus carpio L., 1758) using the micronucleus test and comet assay. Environ. Toxicol. 28, 644–651. Silva Filho, P. B. Efeitos do Roundup® e do Thiodan® em adultos de Astyanax bimaculatus (Characidae: Teleostei): Valores de CL50 e morfologia testicular. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) - Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais. 2013. Sobrero, M.C., Rimoldi, F., Ronco, A.E., 2007. Effects of the glyphosate active ingredient and a formulation on Lemna gibba L. at different exposure levels and assessment end-points. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 79, 537–543. T x r D M llo F. (2007). “E to l uso l su lo so r l l l u y l s omun s p s n s st m s lót os l u n j l R o S nt Lu (Uru u y)”. Tesis de Maestría en Ciencias Ambientales. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay. 58 pp. United States Environmental Protection Agency (USEPA). 2,4-D (2,4- Diclhorophenoxyacetic acid). 2003. Disponível em http://www.epa.gov/ (Acessado em 27/05/06). Usepa, 1975. Methods for Acute Toxicity Tests with Fish, Macroinvertebrates, and Amphibians. U.S. Government Printing Office, Washington, DC, p. 62.

121

Usepa, 2002. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms, Fifth edition. U.S. Government Printing Office, Washington, DC 821-R-02-012. Ruiz De Arcaute C, Pérez-Iglesias Jm, Nikoloff N, Natale Gs, Soloneski S, Larramendy M (2014) Genotoxicity evaluation of the insecticide imidacloprid on circulating blood cells of Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae) by comet and micronucleus bioassays. Ecol Indic 45:632-639. Santos M. A. T. D.; Areas M. A.; Reyes F. G. R. Piretróides–uma visão geral. Alimentos e Nutrição Araraquara v. 18 n. 3 p. 339-349 . ISSN 2179-4448. 2011. Santos et al. Eficiência do 2,4-D aplicado isoladamente e em mistura com glyphosate no controle da trapoeraba. Planta Daninha, Viçosa, v.20, n.2, p. 299-309, 2002. Sarikaya R1, Yilmaz M. 2003. Investigation of acute toxicity and the effect of 2,4-D (2,4dichlorophenoxyacetic acid) herbicide on the behavior of the common carp (Cyprinus carpio L., 1758; Pisces, Cyprinidae). Chemosphere. 2003 Jul;52(1):195-201. Senasa (2013) Argentinean National Service for Sanitary and Quality of Agriculture and Food. http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=1506&io=18122. Singh Np (1996) Microgel electrophoresis of DNA from individual cells: principles and methodology. In: Pfeifer GP (ed) Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations. Plenum Press, New York, pp 3-24 Souza JP. Toxicidade Aguda e Risco Ambiental do Diflubenzuron para Daphia magna,Poecilia reticulata e Lemna minor na Ausência e Presença de Sedimento. Dissertação Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura; Jaboticabal, São Paulo. 2008. Souza TS and Fontanetti CS (2007) Ensaio do cometa para avaliação das águas do rio Paraíba do Sul, numa área sob influência de uma refinaria de petróleo. 4º Congresso Brasileiro de P&D em Petróleo e Gás-PDPETRO, 2007, Campinas, p. 1-10, http://www.portalabpg.org.br/PDPetro/ 4/resumos/4PDPETRO_6_2_0018-1.pdf (August 5, 2008). Scasso F, N. Mazzeo, J. Gorga, C. Kruk, G. Lacerot, J. Clemente, D. Fabián & S. Bonilla (2001). Limnological changes of a subtropical shallow hypertrophic lake during its restoration. Two years of whole-lake experiment. Aquatic Conservation: Marine Freshwater Ecosystems 11: 3144. Tatum Vl, Borton Dl, Streblow Wr, Louch J, Shepard Jp (2012) Acute toxicity of commonly used forestry herbicide mixtures to Ceriodaphnia dubia and Pimephales promelas. Environ Toxicol 27:671-684. Van Der Oost, R.; Beyer, J.; Vermeulen, N. P. E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 13, n. 2, p. 57–149, fev 2003.

122

Vera-Candioti, J., Soloneski, S., Larramendy, M.L., 2013a. Chlorpyrifos-based insecticides induced genotoxic and cytotoxic effects in the ten spotted live-bearer fish, Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842). Environ. Toxicol. 29,1390–1398. Vera-Candioti, J., Soloneski, S., Larramendy, M.L., 2013b. Evaluation of the genotoxic and cytotoxic effects of glyphosate-based herbicides in the ten spotted livebearer fish Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842). Ecotoxicol. Environ. Saf. 89, 166–173. Vera-Candioti, J., Soloneski, S., Larramendy, M.L., 2013c. Single-cell gel electrophoresis assay in the ten spotted live-bearer fish, Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842), as bioassay for agrochemical-induced genotoxicity. Ecotoxicol.Environ. Saf. 98, 368–373. Vera-Candioti, J., Soloneski, S., Larramendy, M.L., 2015. Pirimicarb-based formulationinduced genotoxicity and cytotoxicity on the fresh water fish Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842) (Pisces, Poeciliidae). Toxicol. Ind. Health 31, 1051–1060. Vignardi,C.P.2012.Avaliação Da Genotoxicidade Da Nanopartícula Tio2 Em Juvenis De Pampo s, Trachinotus Carolinus (Linnaeus, 1766), Através de Métodos Citogenotóxicos. IO-Instituto Oceanográfico 615.9 V736a. Wang, C.J.; Liu, Z.Q. Foliar uptake of pesticides: presente status and future challenge. Pesticide Biochemistry and Physiology, San Diego, v.87, p.1-8, 2007. Walker, C. H. et al. Principles of ecotoxicology. 3. ed. Boca Raton: Taylor & Francis Group. 2006.

123

CONCLUSÃO GERAL 

As combinações de herbicidas são bastante utilizadas em todo o mundo para o aumento da produção agrícola e no controle de pragas, portanto é importante avaliar o efeito agudo de formulações de Glifosato, 2,4-D e Imazethapyr em organismos aquáticos, via ensaio cometa e teste do micronúcleo.



Informações sobre as concentrações de formulações de 2,4-D (éster, amina e ácido), glifosato e Imazethapyr sozinhos ou combinados no meio ambiente são necessários para avaliar o risco de substâncias tóxicas sobre os organismos aquáticos.



Analisar as interações genotóxicas de 5% e 10% dos herbicidas Credit®, Pivot® Herbifen Super®, Weedar Full® e Dedalo elite® (sal, éster e amina) em organismos aquáticos.

124

ANEXO I – Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO).

125

126

127

128

ANEXO II – Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA).

129

130