Estudos In Vitro e In Vivo de conversão e agregação da proteína prion

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO DE CONVERSÃO E AGREGAÇÃO DA PROTEÍNA PRION: EFEITO DE ÁCIDOS NUCLEICOS E A PROPOSTA DE UM MODELO DE AGREGAÇÃO AMILOIDE

BRUNO MACEDO DA SILVA

RIO DE JANEIRO *2016*

1

LOMBADA

Bruno Macedo da Silva

Estudos in vitro e in vivo de conversão e agregação da proteína prion: efeito de ácidos nucleicos e a proposta de um modelo de agregação amiloide

UFRJ/FF

V.I

2

BRUNO MACEDO DA SILVA

ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO DE CONVERSÃO E AGREGAÇÃO DA PROTEÍNA PRION: EFEITO DE ÁCIDOS NUCLEICOS E A PROPOSTA DE UM MODELO DE AGREGAÇÃO AMILOIDE Volume I

Tese de doutorado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

da

Faculdade

de

Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Yraima Cordeiro

Rio de Janeiro *2016* 3

FICHA CATALOGRÁFICA

DA SILVA, BRUNO MACEDO. Estudos in vitro e in vivo de conversão e agregação da proteína prion: efeito de ácidos nucleicos e a proposta de um modelo de agregação amiloide. Bruno Macedo da Silva. Rio de Janeiro: FF/UFRJ, 2016. 217 fls. Orientadora: Yraima Moura Lopes Cordeiro Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. Referências Bibliográficas: 178-190 1. Prion 2. Ácidos Nucleicos 3. Agregação 4. Amiloide I. Cordeiro, Yraima Moura Lopes II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas III.

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Bruno Macedo da Silva Estudos in vitro e in vivo de conversão e agregação da proteína prion: efeito de ácidos nucleicos e a proposta de modelo de agregação amiloide Tese submetida ao corpo docente da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Rio de Janeiro, 20 de dezembro de 2016.

Doutora Yraima Moura Lopes Cordeiro, Professora Associada, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro (Orientadora)

Doutora Débora Foguel, Professora Titular, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro _____________________________________________________________________ Doutor Marcius da Silva Almeida, Professor Associado, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro ______________________________________________________________________ Doutora Julia Helena Rosauro Clarke, Professora Adjunta, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro ______________________________________________________________________ Doutora Tuane Cristine Ramos Goncalves Vieira, Professora do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (Revisora) ______________________________________________________________________ Doutor Luis Mauricio Trambaioli da Rocha e Lima, Professor Associado, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro (Suplente Interno)

Doutor Fernando Palhano, Professora Adjunto, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro (Suplente Externo) 5

Ao meu amado pai, Ismael da Silva À minha brilhante irmã, Dra. Isamhara Macedo

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“Desistir... eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério; é que tem mais chão nos meus olhos do que o cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos meus passos, do que tristeza nos meus ombros, mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça. ” (Cora Carolina) 7

AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, sempre! Sem ele eu não teria superado tantas dificuldades, nem viveria para escrever esse momento. Existe uma força maior dentro de mim que não me deixa desistir nunca daquilo que eu acredito e dos sonhos que eu idealizo mesmo frente às tantas adversidades da vida. Tenho certeza que essa força é Deus! À Ele e a nossa Senhora, meu muito obrigado! Àquele que não deixa a peteca cair, que é uma mão na roda, um alívio, um presente de Deus e o maior motivo deu ter chegado até aqui: para você, meu querido pai, meu muitíssimo obrigado! É tanto amor que não cabe nas palavras, escorre pelos olhos. Obrigado por se dedicar tanto a gente! Não sei se eu terei filhos um dia, mas tenho certeza que guardo um amor muito grande para eles, o mesmo que você me ensina todos os dias. Te amo muito! À minha orientadora, Yraima Cordeiro, por ter me guiado até aqui desde a minha iniciação científica, por uma década inteira me ensinando como fazer Ciência de qualidade. Para você credito tudo que aprendi como um bom pesquisador, da bancada para as análises experimentais, até as escritas e a visão crítica de um artigo científico. Muito obrigado por toda a paciência comigo! Aos membros da banca, por gentilmente terem aceitado o convite de participar da minha defesa. Aos membros do LaBiME pela companhia ao longo desses anos e por toda as ajudas de trabalho experimental. Agradeço, em especial, a Natália, essa garota que se tornou uma grande amiga e fez os meus dias no laboratório mais alegres e descontraídos. Muito obrigado! A Dra. Mariana, por ter acompanhado minha jornada científica e ter sido uma grande colaboradora dos nossos estudos. Obrigado por tudo, biscoito! A professora Tuane por estar sempre disposta a me ajudar e por ter revisado com carinho esta tese. Lembro que meu primeiro contato com laboratório foi como seu aluno, trabalhando com a PrP que não me largou até hoje. Ao professor Luis Maurício, por ceder de bom grado o espaço do seu laboratório para a realização de muitos experimentos desta tese. 8

À minha irmã caçula, Isamhara, eu já agradeço só por existir. Minha outra metade, meu lado mais doce e o maior amor da minha vida! Obrigado por estar sempre do meu lado, por acreditar de mim e, principalmente, obrigado por ser essa pessoa maravilhosa, nossa futura médica, que só nos enche orgulho! À Raony, um grande irmão que Deus que me permitiu escolher. Obrigado pelos longos anos de amizade, por escrever comigo minhas melhores histórias e por trazer mais alegria para minha vida. Te amo, Mão! À Vanessa, minha grande amiga! Tão única e dona de um espaço imenso no meu coração. Obrigado por me confortar sempre, perdoar meus erros e nunca me deixar para trás. Por isso que você é a Donna, e eu amo você! Aos meus amigos incríveis, Murilo e Renatinho por todas as viagens, festas e alegrias compartilhadas. E claro, por cuidar de mim também. Estou cercado de pessoas incríveis, que considero parte da minha família. Á todos os meus amigos especiais, eles sabem quem são, que entre idas e vindas, marcaram e fazem parte da minha vida ou história. A Natália Moutella (Bê), Júlio (Sis), Leo, Ricardinho, Nati Varejão, entre muitos outros... À Maria Isabelly, por ter me acolhido na sua casa nos últimos meses do meu doutorado sanduíche em Barcelona e ter me ensinado tanto sobre a vida, coisas que eu jamais aprenderia dentro de uma Universidade. Você foi um anjo no meu caminho! Conforme prometido para você, um parágrafo único e muito especial de agradecimento. Desejo-te todo o sucesso do mundo! E, claro, sinto saudade. A todos os meus familiares, minhas irmãs e irmãos, principalmente à minha avó Cleuza e minha mãe de coração, Darlene, por todas as orações, torcidas e incentivos. Obrigado por acreditarem em mim, até quando eu mesmo não acreditava. E, por último, agradeço aquela estrela mais brilhante do céu que ilumina a minha vida, ao meu anjo da guarda que me protege todos os dias, Mãe, obrigado por cuidar de mim mesmo distante, e obrigado pela força, pois te orgulhar é um dos principais motivos que sustentam em pé. Esta tese também é sua! Te amo MUITO!

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RESUMO MACEDO, Bruno. Estudos in vitro e in vivo de conversão e agregação da proteína prion: efeito de ácidos nucleicos e a proposta de um modelo de agregação amiloide. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro. A conversão estrutural e a agregação da proteína prion (PrP) são processos chaves para a deflagração das Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (ETTs). A hipótese protein-only, que é amplamente aceita propõe que o agente etiológico dessas doenças é uma molécula unicamente proteica que apresenta conformações anormais da PrP que estão associadas com as suas propriedades transmissíveis e infecciosas. Entretanto, vem crescendo as evidências que suportam a hipótese de cofatores moleculares que podem auxiliar o processo de conversão da PrP. Nesta tese desenvolvemos e aplicamos diferentes abordagens, englobando estudos in vitro e in vivo, para compreender os mecanismos de patogênese da PrP, uma proteína especial por descrever um novo fenômeno dentro da biologia molecular: as habilidades de uma proteína sozinha de sofrer autoconversão, autopropagação e disseminação entre as células vizinhas. No primeiro capítulo, expandimos nossos estudos de interação da PrP com ácidos nucleicos (NAs), como potenciais cofatores moleculares da PrP, e discutimos aspectos importantes dessa interação. Nós identificamos pela metodologia de SELEX novas sequências de DNA de alta afinidade (aptâmeros) contra a PrP e determinamos os parâmetros termodinâmicos de interação da proteína e de seus domínios isoladas com moléculas de DNA, RNA e com os aptâmeros. Vimos que a interação com os mesmos oligonucleotídeos que mostramos ser capazes de induzir a conversão estrutural e agregação da rPrP in vitro, pode promover a formação de estruturas tóxicas da PrP para modelos in vivo. Nossos resultados mostraram que a inoculação do complexo rPrP:D67 em camundongos saudáveis promove efeitos subclínicos de disfunção cognitiva. Por outro lado, vimos que os mesmos oligonucleotídeos testados individualmente são capazes de inibir a propagação de prion em células permanentemente infectadas com a cepa 22L ou RML e de reduzir o acúmulo da forma infecciosa em modelos de conversão livre de células. Concluímos que essas duas moléculas (PrP e NA) podem interagir de tal maneira que é possível modular a propagação da PrP, por dificultar ou estimular a reação de conversão, dependendo das condições experimentais de interação. Nós propusemos também que no polimorfismo estrutural das pequenas sequências de ácidos nucleicos pode ser encontrado o padrão molecular mais importante em dirigir as interações mais específicas com a PrP. No segundo capítulo, dedicamos nossos esforços parar tentar recriar prions infecciosos propondo um sistema rápido e eficiente para o estudo de agregação amiloide de PrPs de mamíferos, na forma de corpos de inclusão dentro da bactéria. Apesar de serem organismos bem mais simples, nesse modelo expomos a proteína a fatores celulares que acreditamos serem importantes para promover uma eficiente conversão, como a interação com ácidos nucleicos no interior da célula. Nossos resultados mostraram a formação de agregados amiloides da PrP murina dentro de bactéria. Além disso, identificamos diferentes estruturas, estabilidade, toxicidade e perfil de resistência a digestão por PK dependendo da construção da PrP avaliada. Apresentamos esse sistema como um modelo interessante de formação de prions que pode recapitular a agregação da PrP sobre condições biológicas relevantes e fornecer quantidades suficientes de formas agregadas para futuros estudos estruturais, de infecção e de transmissão.

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ABSTRACT MACEDO, Bruno. In vitro and in vivo studies of prion protein (PrP) conversion and aggregation: the role of nucleic acid the proposal of an amyloid aggregation model. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Prion protein (PrP) structural conversion and aggregation are key events for the onset of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE). The ‘protein-only’ hypothesis that is commonly accepted propose that the etiological agent of these diseases is a proteinaceous solely molecule that present PrP abnormal conformations, which are associated with their transmissible and infectious properties. However, the evidences supporting the hypothesis of molecular cofactors that could assist the process of the protein conversion have been growing significantly. In this thesis, we developed and applied multiple approaches, encompassing in vitro and in vivo studies, to comprehend the pathogeneses mechanisms of the PrP, a special protein by describe a new phenomenon inside the molecular biology: the abilities of protein alone to suffer self-conversion, selfpropagation and dissemination between neighbor cells. In this first chapter, we have expanded our studies about the interaction of PrP and nucleic acids, as potential PrP molecular cofactors, and we discussed important aspects of this interaction. We identified, through the SELEX methodology, new high-affinity DNA sequences (aptamers) against PrP and we determined the thermodynamic parameters of interaction of PrP and their isolated domains with DNA, RNA and the aptamers. We observed that the interaction with the same oligonucleotides we have shown to be able to induce rPrP structural conversion and aggregation in vitro, can promote the formation of toxic PrP structures to in vivo models. Our results showed that the inoculation of rPrP:D67 complex in healthy mice lead to subclinical effects of cognitive impairments. On the other hand, we observed that those same oligonucleotides tested individually can inhibit prion propagation of 22L and RML strains in permanently infected cell, and can reduce the levels of the infectious form in cell-free conversion model. We concluded that these two molecules can interact in such a way that is possible do modulate PrP conversion, by hampering or stimulating the reaction conversion, depending on the experimental conditions of interaction. We also proposed that in the structural polymorphism of small nucleic acids sequence could be found the most important molecular pattern to drive more specifics interactions with PrP. In the second chapter, we dedicated our efforts trying to reproduce infectious prions, by proposing a fast and efficient system to study amyloid mammalian PrPs aggregation in inclusion bodies forms inside bacteria. Although they are much simpler organism, in this model we exposed the protein to cellular factors that we do believe are important to promote an efficient conversion, i.e. the interaction with nucleic acids inside the cell environment. Our results showed the formation of amyloid aggregates by murine PrP inside bacteria. Furthermore, we identified conformationally different amyloid structure, different stability, toxicity, and PK-digestion resistance profile depending on which constructions was incorporated in the bacterial genome. We presented this system as an interesting model of prions production that can recapitulate PrP aggregation in more biologically relevant conditions and can provide yield amounts of aggregated forms for further structural, infectious and transmission studies. 11

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Diagrama do funil termodinâmico de enolevamento proteico. ........................ 19 FIGURA 2. Espécies presentes ao longo de uma cinética de agregação dependente de nucleação. ................................................................................................................................... 24 FIGURA 3. Características das fibras amiloides. .................................................................. 25 FIGURA 4. Características histopatológicas das EETs. ........................................................ 30 FIGURA 5. Proteína Prion.. ..................................................................................................... 34 FIGURA 6. Estrutura e conversão da proteína prion. . ........................................................ 37 FIGURA 7. Modelo proposto para a conversão do PrPC em PrPSc. ..................................... 39 FIGURA 8. Diagrama de energia livre representando o papel de cofatores na conversão estrutural da PrP. ...................................................................................................................... 44 FIGURA 9. Representação esquemática do processo de SELEX.. ....................................... 55 FIGURA 10. Espectro de CD para estrutura secundária de proteínas. ............................... 68 FIGURA 11. Modelo esquemático do ITC. ............................................................................. 69 FIGURA 12. Efeito de DNAs ou RNA na agregação e estrutura da rPrP. .......................... 82 FIGURA 13. Efeito de DNAs na estrutura terciária e agregação da rPrP∆51-90.. ................. 84 FIGURA 14. Ensaios de supressão de fluorescência da rPrP na presença de DNA............ 86 FIGURA 15. Efeito de DNAs na estrutura secundária da rPrP. .......................................... 88 FIGURA 16. Ensaio de estabilidade térmica da rPrP na presença de DNA........................ 90 FIGURA 17. Espectro de CD de DNAs livres em solução.. ................................................... 91 Figura 18. Concentração e tamanho dos agregados da rPrP formados na presença de D67. ..................................................................................................................................................... 95 FIGURA 19. Ligação de DNA não induz agregação da PrP90-231. ......................................... 96 FIGURA 20. Ligação do DNA altera estrutura terciária da rPrP90-231.. .............................. 97 FIGURA 21. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com D44........................... 99 FIGURA 22. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com D67......................... 100 FIGURA 23. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com R67......................... 101 FIGURA 24. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com D44 e D67. ............. 102 FIGURA 25. Morfologia da PrP106-126 na presença de ácidos nucleicos visto por TEM.... 105 FIGURA 26. Ensaio de disfunção celular do peptídeo rPrP106-126 na presença de DNA, RNA. ......................................................................................................................................... 106 FIGURA 27. Efeito de oligonucleotídeos de DNA na propagação de prions. .................... 107 FIGURA 28. Western blot do produto da reação de RT-QuIC com semente de cérebro de camundongo infectado.. .......................................................................................................... 110 FIGURA 29. Western blot do produto da reação de RT-QuIC com semente de cérebro de camundongo infectado. ........................................................................................................... 111 FIGURA 30. Pole Teste para avaliar a habilidade motora de camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA.. ........................................... 113 FIGURA 31. Teste de exploração em campo aberto para avaliar a habilidade motora de camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA.. ................................................................................................................................................... 113 FIGURA 32. Teste do medo condicionado em camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA. ............................................................... 114 FIGURA 33. Teste do plus-maze elevado em camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA.. .............................................................. 115 FIGURA 34. Gel de agarose a 2% dos aptâmeros para rPrP90-231 (C-terminal estendido) eluídos em gradiente de concentração salina. ....................................................................... 119 FIGURA 35. Gel de agarose a 2 % dos plasmídeos obtidos por miniprep após clonagem dos aptâmeros. ......................................................................................................................... 120 12

FIGURA 36. Gel de agarose a 2 % dos aptâmeros isolados para rPrP90-231 (C-terminal estendido).. ............................................................................................................................... 120 FIGURA 37. Alinhamento das sequências dos aptâmeros A8 e A9 com os primers......... 121 FIGURA 38. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos aptâmeros A8 e A8. .......................................................................................................................................... 122 FIGURA 39. Alinhamento das sequências complementares de A8 e A9............................ 123 FIGURA 40. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos aptâmeros A1 e A2. .......................................................................................................................................... 124 FIGURA 41. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos aptâmeros A3 e A4. .......................................................................................................................................... 125 FIGURA 42. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos aptâmeros A3 e A4. .......................................................................................................................................... 126 FIGURA 43. Eletroferograma obtido na análise de sequenciamento de aptâmero A7. ... 127 FIGURA 44. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com A1........................... 130 FIGURA 45. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com A2. .......................... 131 Figura 46. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com A1.. ......................... 132 Figura 47. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com A2. .............................. 133 FIGURA 48. Cinética de agregação da rPrP23-231 após ligação com aptâmeros. ............... 135 FIGURA 49. Nanoparticle Tracking Analysis da interação da rPrP23-231 com A1.. .......... 136 FIGURA 50. Nanoparticle Tracking Analysis da interação da rPrP23-231 com A2. ........... 137 FIGURA 51. Morfologia da rPrP23-231 na presença dos aptâmeros A1 e A2. ..................... 137 FIGURA 52. Morfologia da rPrP90-231 na presença dos aptâmeros A1 e A2. ..................... 137 FIGURA 53. Conformações adotadas por proteínas recombinantes dentro de bactérias 141 FIGURA 54. Arquitetura do complexo entre PrP bovina e o aptâmero R12. ................... 170

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LISTA DE TABELAS TABELA 1. Doenças humanas associadas com a formação de depósitos amiloides ........... 26 TABELA 2. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis.................................................. 28 Tabela 3. Propriedades de ligação de aptâmeros e outros NAs ligantes da PrP.................. 51 TABELA 4. Sequência dos ácidos nucleicos avaliados .......................................................... 61 TABELA 5. Alinhamento das sequências de aminoácidos do peptídeo PrP109-149 de hamsters sírios e de humanos ................................................................................................... 63 TABELA 6. Constantes de Stern-Volmer (KSV) ..................................................................... 87 TABELA 7. Distribuição de tamanho dos complexos rPrP23-231:DNA ................................. 93 TABELA 8. Parâmetros termodinâmicos da interação da PrP com ácidos nucleicos ........ 99 TABELA 9. Sequência dos aptâmeros selecionados contra a PrP90-231 .............................. 127

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 16 1.1. Enovelamento proteico ...................................................................................... 16 1.2. Agregação proteica ............................................................................................ 20 1.3. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EETs) .................................. 27 1.4. Propagação de prions ........................................................................................ 31 1.5. A proteína prion ................................................................................................ 33 1.6. Conversão estrutural da PrP ............................................................................ 36 1.7. Cepas de prions .................................................................................................. 40 1.8. Prions sintéticos ................................................................................................. 42 1.9. Cofatores da conversão ..................................................................................... 43 2. OBJETIVOS GERAIS ..................................................................................... 48 3. CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO ..................................................................... 49 4. CAPÍTULO 1 - OBJETIVOS .......................................................................... 59 5. CAPÍTULO 1 - MATERIAL E MÉTODOS................................................. 60 6. CAPÍTULO 1 - RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................... 80 7. CAPÍTULO 2 - INTRODUÇÃO ....................................................................... 140 8. CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS........................................................................... 143 9. CAPÍTULO 2 - PUBLICAÇÕES .................................................................... 144 9.1. Artigo I ............................................................................................................. 9.2. Artigo II ............................................................................................................ 10. DISCUSSÃO GERAL ........................................................................................ 167 11. CONCLUSÕES................................................................................................... 176 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 177 12. APÊNDICES ....................................................................................................... 202 12.1. Artigo III ........................................................................................................... 12.2. Artigo IV............................................................................................................

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1. INTRODUÇÃO

As proteínas são as macromoléculas biológicas de maior abundância nos organismos vivos onde participam da grande maioria das atividades fundamentais à fisiologia celular. O processo pelo qual uma cadeia polipeptídica recém-sintetizada no ribossomo transforma-se em uma proteína perfeitamente estruturada e pronta para desempenhar sua função é chamado de enovelamento proteico, e a grande variedade de estruturas altamente específicas que resultam desse enovelamento permitiu que os organismos vivos desenvolvessem uma imensa diversidade e seletividade em suas reações bioquímicas (ENGLANDER; MAYNE, 2014). Dentre as inúmeras funções desempenhadas pelas proteínas, destacamos: componentes estruturais da célula, catalisadores de reações químicas, participação na defesa e sinalização celular, transporte de moléculas, entre outras. Portanto, a formação de uma proteína exige um processo rigoroso e finamente controlado pela maquinaria celular para que seja garantido o seu bom funcionamento. Não é surpreendente, então, que quaisquer falhas nesse processo resultem em danos à saúde celular que, por conseguinte, podem evoluir para diferentes quadros patológicos (KIM et al., 2013). As doenças advindas do mau enovelamento proteico também são conhecidas como doenças conformacionais ou proteinopatias.

1.1.Enovelamento proteico

Durante a biossíntese de proteínas, a cadeia polipeptídica nascente encontra-se no seu estado desenovelado, que é formado apenas pela ordem sequencial de seus aminoácidos (estrutura primária) unidos covalentemente por uma ligação peptídica (BARTLETT; RADFORD, 2009). Porém, para desempenhar sua função biológica corretamente, em geral, é preciso que a proteína disponha seus aminoácidos numa localização espacial correta dentro de uma estrutura tridimensional bem definida para cada proteína, que é conhecida como estado nativo da proteína (CABRITA; DOBSON; CHRISTODOULOU, 2010). A transição do estado desenovelado para o estado nativo é alcançada através do mecanismo de enovelamento proteico, que vai depender tanto das propriedades intrínsecas da sequência de aminoácidos que a forma assim como da influência de múltiplos fatores advindos do meio celular em que ela se encontra. O enovelamento e desenovelamento são caminhos cruciais para regulação da atividade 16

biológica das proteínas e também para o endereçamento das mesmas para determinados compartimentos celulares (CABRITA; DOBSON; CHRISTODOULOU, 2010). Os primeiros trabalhos sobre enovelamento proteico destacaram a existência de arranjos tridimensionais de aminoácidos, que são encontrados em praticamente todas as estruturas proteicas, as α-hélices e as folhas-β (estruturas secundárias) (PAULING e COREY, 1951). Experimentos clássicos realizados por Christian Anfinsen com a ribonuclease A tiveram grande contribuição nessa área e mostraram que o desenovelamento de uma proteína causado pela presença de um agente desnaturante, como a ureia, e um agente redutor como o β-mercaptoetanol, era capaz de ser revertido com a retirada desses agentes, permitindo que a proteína se reenovelasse e retomasse, assim, a sua estrutura nativa, o que o levou a postular que todas as informações necessárias para o enovelamento correto de uma proteína estão contidas na própria sequência primária de aminoácidos que a formam (ANFINSEN e HABER, 1961; ANFINSEN, 1973). Nos anos seguintes, o dogma estabelecido por Anfinsen mostrou-se incompleto, já que algumas proteínas podem requisitar o auxílio complementar das chamadas chaperonas moleculares, que são proteínas assistentes no processo de enovelamento, para poder alcançar sua conformação correta (FRYDMAN E HARTL, 1996). Atualmente, sabemos que o enovelamento é governado pelas leis da termodinâmica, com o estado nativo da maioria das proteínas correspondendo às estruturas mais termodinamicamente estáveis em condições fisiológicas (HARTL; HAYER-HARTL, 2009). O cálculo da estabilidade de uma proteína é o resultado da diferença de energia livre de Gibbs (ΔG) entre estado nativo (final) e o estado desenovelado (inicial) (ROBERTSON; MURPHY, 1997). Um valor negativo de ΔG indica que a transição do estado desenovelado para o nativo é energeticamente favorável e, por isso, pode ocorrer de maneira espontânea. No seu estado nativo a proteína é mantida e estabilizada por diversos tipos de interações químicas, como as ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas entre grupos de cadeias laterais de cargas opostas, interações hidrofóbicas e/ou pontes dissulfeto. Em geral, as interações corretas (nativas) são mais estáveis do que as não nativas, e por isso elas são mantidas durante o enovelamento (CABRITA; DOBSON; CHRISTODOULOU, 2010). Dessa maneira, a cadeia polipeptídica fica restrita a testar, 17

por tentativas e erros, apenas algumas das diversas interações disponíveis, através da formação de estruturas intermediárias bem definidas por rotas cinéticas que escapam de conformações irrelevantes. Os intermediários, parcialmente enovelados, vão se tornando cada vez mais estruturados e menos hidratados à medida que novas interações vão se estabelecendo, permitindo que a cadeia polipeptídica gradualmente alcance sua estrutura de menor energia (SILVA et al., 2010). O caminho energético dirigido pelo enovelamento proteico fica bem representado no diagrama de um funil de energia livre de Gibbs aonde no topo deste funil está a cadeia polipeptídica nascente, no seu estado desenovelado, apresentando alta energia livre e alta entropia conformacional, podendo experimentar diversas conformações aleatórias. Em contrapartida no seu estado nativo, a proteína apresenta menor energia livre e baixa liberdade conformacional, ficando, portanto, ‘presa’ no fundo deste funil em um mínimo de energia local (FIGURA 1) ((HARTL; HAYER-HARTL, 2009; ROBERTSON; MURPHY, 1997).

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FIGURA 1. Diagrama do funil termodinâmico de enolevamento proteico. As proteínas desenoveladas (representadas no topo do diagrama) possuem uma alta entropia conformacional. Enquanto a proteína evolui pelo funil, as espécies intermediárias vão se tornando mais estruturadas e menos hidratadas. Algumas proteínas alcançam uma bifurcação nesse funil entrando na via de formação de proteínas mal enoveladas, gerando conformações metaestáveis, que dependendo das condições podem avançar para espécies mal enoveladas e levar a sua agregação. Figura adaptada de (HARTL; BRACHER; HAYER-HARTL, 2011).

Por se tratar de um processo muito importante para funcionamento normal das células, a maquinaria celular dispõe de diferentes mecanismos para que seja mantido um alto controle de qualidade na produção de proteínas. Além de dispor de proteínas auxiliadoras do enovelamento, conhecidas como chaperonas moleculares, que auxiliam uma proteína mal enovelada e se reenovelar da maneira correta, a célula dispõe também de um sistema de degradação autoproteolítica, conhecido como ubiquitina-proteassoma para o qual são endereçadas as proteínas mal formadas (HIPP; PARK; HARTL, 2014; KIM et al., 2013). Nos casos em que os erros ocasionados ao longo do enovelamento não são revertidos, a célula pode ainda recorrer mecanismos de degradação autofágicos e lisossomais (KIM et al., 2013).

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Apesar de altamente controlado e bem assistido, estes mecanismos podem falhar e as proteínas mal formadas podem se acumular na forma de depósitos insolúveis nas células e nos tecidos e prejudicar o organismo, seja através da perda de função biológica da proteína em questão ou pelo ganho de função tóxica desses acúmulos proteicos indesejados. Nesse âmbito, muitas doenças já foram descritas, incluindo a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e as Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (CHITI; DOBSON, 2006; KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014).

1.2. Agregação proteica

A redução da quantidade de uma proteína disponível para desempenhar sua função, seja através do aumento da sua degradação pelo sistema de controle de qualidade ou mesmo por falhas em endereçar essa proteína ao seu compartimento correto podem evoluir para diferentes patologias. Porém, o maior grupo das doenças do mau enovelamento proteico está associado com acúmulo de proteínas mal enoveladas na forma de agregados proteicos insolúveis, com prejuízo aos tecidos e órgãos onde se depositam (KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). Como vimos anteriormente, para alcançar seu estado conformacional nativo, o enovelamento de uma proteína acessa alguns estados conformacionais intermediários em busca da sua estrutura final de menor energia. Em determinadas ocasiões, alguns intermediários do enovelamento assumem conformações metaestáveis que os acomodam num mínimo de energia local, e que podem os desviar da via de enovelamento funcional para a via de mau enovelamento e agregação (FIGURA 1). Os intermediários mal formados podem expor domínios hidrofóbicos que normalmente estariam escondidos no interior da proteína no seu estado nativo e, por isso, apresentam alta capacidade de associar-se uns aos outros, formando agregados proteicos de menor tamanho (oligômeros) que podem evoluir para agregados maiores (polímeros) (ENGLANDER; MAYNE, 2014). Dessa forma, a existência de regiões ricas em aminoácidos apolares dentro de uma proteína pode, por um lado, ser necessária para guiar o seu enovelamento correto, já que rapidamente tendem a excluir-se do contato com a água, ditando os primeiros contatos nativos intramoleculares, mas pode também favorecer a via de

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agregação através de interações intermoleculares, fazendo com que esses dois eventos sejam a todo tempo “concorrentes” dentro da célula ou, até mesmo, em tubos de ensaios. As características que levam uma proteína solúvel a adotar uma estrutura alternativa com alta propensão a agregação dependem, então, dos diferentes intermediários formados durante o processo de enovelamento, dos estados energéticos desses intermediários, da barreira de energia livre que separa esses estados, e da superfície hidrofóbica exposta ao solvente (SILVA et al., 2010). Mutações genéticas, modificações pós-traducionais errôneas, assim como variações no ambiente químico (alterações no pH e temperatura) de uma determinada proteína também podem disparar o processo de agregação (UVERSKY; DUNKER, 2010). É importante lembrar que o enovelamento ocorre em um ambiente celular lotado de outras macromoléculas e solutos, de forma que a cadeia polipeptídica precisa seguir a rota produtiva evitando contatos intermoleculares indesejáveis (WANG et al., 2012). A interação de proteínas com outras moléculas que não são seus parceiros nativos, podem levar a alterações na estabilidade e estrutura dessas proteínas e favorecer sua agregação, conforme já foi visto para a interação de algumas proteínas com ácidos nucleicos, lipídeos, glicosaminoglicanos ou íons metálicos (ATWOOD et al., 1998; CORDEIRO et al., 2014a; LIU; ZHANG, 2011; MACEDO et al., 2012; VIEIRA et al., 2011) O envelhecimento reduz a eficiência dos mecanismos de controle de qualidade da biossíntese proteica em determinados tecidos que gradualmente perdem sua capacidade de prevenir o acúmulo de proteínas mal formadas, justificando a maior prevalência das doenças conformacionais na população senil (BRIGNULL; MORLEY; MORIMOTO, 2007). Dependendo das características estruturais, morfológicas e tintoriais, os agregados proteicos podem ser classificados em amorfos ou amiloides (CHITI; DOBSON, 2006) (FIGURA 1). Os tipos de agregados predominantes, em geral, são determinados pela sequência de aminoácidos da proteína e a natureza dos intermediários do enovelamento formados (KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014) Nesta tese estudamos diferentes modelos de agregação da PrP, incluindo aqueles induzidos pela interação com ligantes como os ácidos nucleicos (CAPÍTULO I), e também um modelo de agregação in vivo da PrP realizado dentro de bactérias na forma de corpos de inclusão (CAPÍTULO II). 21

1.2.1. Agregados Amorfos

A formação de agregados amorfos, que não possuem uma estrutura definida, ocorre rapidamente, a partir da adição desorganizada de monômeros individuais ao crescente aglomerado de proteínas agregadas. Esses agregados apresentam intermediários parcialmente enovelados com uma conformação estendida que, eventualmente, podem tornar-se grandes o suficiente e formarem precipitados insolúveis (MORRIS; WATZKY; FINKE, 2009).

1.2.2. Agregados amiloides

O processo de agregação proteica pode ocorrer também de maneira altamente específica, bem organizada e levar a formação de um arranjo supramolecular de morfologia fibrilar e com uma arquitetura bastante característica, composto principalmente de folhas-β intercruzadas ao longo do eixo da fibra amiloide madura (EISENBERG; JUCKER, 2012; KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). Uma proteína fibrilar amiloide se deposita como fibras insolúveis, principalmente nos espaços extracelular de órgãos e tecidos, e são resultantes de mudanças sequenciais no enovelamento proteico, resultando em condições conhecidas como amiloidoses (SIPE et al., 2016). De acordo como o Comitê de Nomenclatura da Sociedade Internacional de Amiloidoses, a fibra amiloide deve exibir afinidade pelo corante vermelho do Congo, que quando ligado as estruturas amiloides apresentam birrefringência verde, amarela ou laranja visualizada sob luz polarizada (SIPE et al., 2016). Enquanto a afinidade pelo vermelho do congo permanece como o padrão ouro para diagnosticar depósitos amiloides, outros marcadores como a sonda tioflavina-T (BIANCALANA; KOIDE, 2010), que apresenta ganhos significativos de emissão de fluorescência mediante a ligação a essas estruturas, também são utilizados. A construção da fibra amiloide demora mais tempo e ocorre em etapas, o intermediário

do

enovelamento

mal

enovelada,

chamado

de

intermediário

amiloidogênico, tendem a associar-se em agregados menores para formar um núcleo estável de menor energia livre de Gibbs, comumente chamado de semente (EICHNER; 22

RADFORD, 2011). A formação dessas sementes é a etapa cinética mais lenta dessa rota de agregação, chamada de fase lag (fase de nucleação), ao final dessa fase é alcançada uma concentração suficiente dessas sementes que se tornam, então, competentes para iniciar o processo de crescimento e alongamento da fibra amiloide (fase de elongação) (FIGURA 2). Enquanto não for alcançada essa concentração ‘crítica’ de sementes, a fase de elongação não se inicia (EICHNER; RADFORD, 2011). Essas sementes são formadas por oligômeros rearranjados que podem servir como molde para recrutar outros intermediários que são sequencialmente adicionados às extremidades do filamento agregado fibrilar crescente, em um modelo de agregação conhecido como nucleação mediada por semente (EICHNER; RADFORD, 2011; JARRETT; LANSBURY, 1993). Uma das características mais importantes compartilhadas por esses núcleos amiloides de diferentes proteínas é a grande área de regiões hidrofóbicas acessíveis ao solvente que servirá como ponto de contato para a adição sucessiva de novos monômeros amiloidogênicos que formaram a fibra (KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). A fase de nucleação pode ser encurtada pela adição de sementes pré-formadas, em um processo de semeadura, que podem ser obtidos, por exemplo, pelo fracionamento natural ou forçado (in vitro ou in vivo) de fibras maduras previamente formadas (WALKER; JUCKER, 2015).

23

FIGURA 2. Espécies presentes ao longo de uma cinética de agregação dependente de

nucleação. Monômeros competentes (monômeros rearranjados) podem se associar em uma reação energeticamente desfavorável para a formação dos núcleos de agregação na fase lag ou de nucleação. Após a formação dos núcleos ou fim da fase lag, segue-se uma etapa mais rápida com a incorporação de monômeros aos núcleos e oligômeros que darão origem às fibrilas. A parte superior da figura ilustra como a adição de núcleos préformados (sementes) pode diminuir a fase de nucleação, acelerando a cinética. Adaptado de EICHNER; RADFORD, 2011. Os agregados amiloides apresentam estrutura fibrilar que podem ser facilmente identificados por microscopia eletrônica como filamentos contínuos com diâmetro que pode variar dependendo da proteína formadora (SUNDE et al., 1997; SUNDE; BLAKE, 1997). A sua organização estrutural é bastante peculiar com um padrão de difração de raios-x típico, com uma reflexão meridional de 4,7 Å e uma reflexão equatorial de 6 a 11 Å, no qual o primeiro valor de distância correspondente ao espaço entre as fitas-β e o segundo corresponde à distância entre as folhas-β empilhadas (SUNDE et al., 1997) (FIGURA 3). Apesar de muito parecidas, algumas diferenças estruturais podem ser apontadas quando analisadas por técnicas mais refinadas como ressonância magnética nuclear (RMN) (EISENBERG; JUCKER, 2012). O polimorfismo estrutural observado desmente a ideia de que as entidades amiloides são idênticas, como se têm pensado por muitos anos.

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FIGURA 3. Características das fibras amiloides. (A) As fibras amiloides são compostas de filamentos visíveis ao microscópio eletrônico de transmissão. (B) Esquema do posicionamento das fitas-β e folhas-β na fibra, com as ligações de hidrogênio representadas por pontilhados. (C) Padrão de difração de raios-X de cruz-β. Os detalhes característicos são a reflexão meridional de aproximadamente 4,8 Å e a reflexão equatorial da ordem de 10 Å. O espaçamento de aproximadamente 4,8 Å dentro de cada folha-β é paralelo ao eixo longo da fibra. O espaçamento de 10 Å folha a folha pode variar de 5 a 14 Å dependendo do tipo da cadeia de aminoácido. Adaptado de (GREENWALD; RIEK, 2010)

Proteínas que não compartilham qualquer grau de parentesco podem gerar essas estruturas regulares, bem ordenadas e com alta estabilidade termodinâmica que estão associadas com o surgimento de diversas doenças conformacionais, especialmente conhecidas como amiloidoses (KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). Evidências experimentais sugerem que se encontrada as condições adequadas, muitas proteínas podem agregar em fibras amiloides, sugerindo que a formação dessas estruturas ocorra, pelo menos em parte, por interações entre os grupamentos da cadeia principal do esqueleto polipeptídico (CHITI et al., 1999). No geral, a formação de agregados amiloides é tóxica para as células e, por isso, está associada a diferentes patologias altamente debilitantes (TABELA 1). Entretanto, já foram identificadas algumas outras proteínas formando fibras similares, para cumprir seu papel fisiológico normal dentro das células, conhecidas como amiloides funcionais (MAURY, 2009). Amiloides funcionais são encontrados em diversos organismos, de bactérias aos mamíferos, com diferentes funções como, por exemplo, a formação de biofilmes, regulação da síntese de melanina, controle epigenético de poliaminas, entre outras (MAURY, 2009).

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TABELA 1. Doenças humanas associadas com a formação de depósitos amiloides

Doença

Proteína Envolvida

Doença de Alzheimer

Peptídeo β-amiloide

Encefalopatia espongiforme*

Prions* α-sinucleína

Sistema

Superóxido dismutase I

Nervoso

Doença de Parkinson Esclerose amiotrópica lateral

Distribuição

Doença de Huntington

Huntintina

Amiloidose AL

Imunoglobulina de cadeia leve

Amiloidose AA

Proteína amiloide A

Polineuropatia amiloidótica

Sistêmica

Transtirretina

familiar Amiloidose Senil Complicação para pacientes com

Transtirretina Beta 2-Microglobulina

deficiência renal Diabetes tipo II

Músculo esquelético

Amilina (IAPP)

Pâncreas

Fator atrial natriurético

Coração

Amiloidose córnea

Lactoferrina

Olhos

Catarata

γ-cristalina

Olhos

Prolactinoma pituitário

Prolactina

Hipófise

Amiloidose atrial

*Nem sempre são encontrados agregados do tipo amiloide no cérebro de indivíduos acometidos com doenças por prions e acredita-se que a formação de amiloides não seja necessária para a infecciosidade do prion. Tabela adaptada (CHITI; DOBSON, 2006).

1.2.4 Espécies tóxicas na via agregação

Durante muito tempo, acreditava-se que os efeitos deletérios a tecidos ou órgãos estavam associados com a presença da fibra amiloide madura, mas, hoje em dia, os estudos vêm mostrando que a citotoxicidade pode não estar relacionada diretamente à fibra per se, mas principalmente aos seus precursores, as espécies oligoméricas. Apesar da deposição intracelular, ou extracelular da placa amiloide ser prejudicial, e ter sido 26

demonstrado a toxicidade das fibras maduras (LORENZO; YANKNER, 1994; NOVITSKAYA et al., 2006) diversos trabalhos mostram que as principais entidades tóxicas são precursoras da fibra, incluindo as espécies solúveis (KAYED et al., 2003), como os dímeros ou trímeros pré-fibrilares, e as espécies oligoméricas produzidas durante os estágios iniciais de formação da fibra (STEFANI, 2012). Os oligômeros são pequenas espécies agregadas de proteínas que estão presentes na fração solúvel do extrato tecidual e, geralmente, incluem estruturas que variam em tamanho de dímeros a 24-monômeros (GLABE, 2008). Muitos pesquisadores acreditam que a formação da fibra madura seja uma estratégica do organismo para isolar essas espécies altamente tóxicas formadas na via de agregação de proteínas associadas a doenças (TABELA 1). Dentre

as

doenças

conformacionais,

as

encefalopatias

espongiformes

transmissíveis (EETs) estão associadas com a deposição de agregados da PrP (PRUSINER, 1998). A PrP pode formar tanto agregados amorfos como amiloide compartilhando características comuns a outras amiloidoses, mas também possuem suas próprias peculiaridades a serem comentadas nos próximos tópicos.

1.3. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EETs)

As doenças causadas por modificações na PrP são conhecidas como EETs, e formam um conjunto de doenças conformacionais, neurodegenerativas, até hoje, invariavelmente fatais, que afetam humanos e diversos animais (TABELA 2). As EETs incluem o kuru, a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), a Insônia Familiar Fatal (FFI), a síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) em humanos, a scrapie em ovelhas, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB), e felina (EEF) e a doença crônica debilitante (CWD) em cervídeos. Todas essas doenças compartilham muitas características fisiopatológicas com outras doenças neurodegenerativas progressivas, envolvendo uma proteína específica, como as doenças de Alzheimer e Parkinson, entretanto parecem ser únicas em relação ao seu caráter infeccioso entre humanos e através de outras espécies.

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TABELA 1. Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis

Doença Scrapie

Hospedeiro

Ano

Ovelhas

1732

Mecanismo de Ação Infecção de animais geneticamente suscetíveis

Doença de Creutzfeldt-

Humanos

1920

Conversão esporádica da PrP

Humanos

1928

Mutações no gene da PrP,

Jakob (CJD) Síndrome de GerstmannStraussler-Scheinker (GSS) Kuru

PRNP Humanos

1957

Infecção através de rituais de antropofagia

Doença debilitante crônica

Cervídeos

1967

(CWD) Insônia Familiar Fatal (FFI)

Mutações no gene da PrP, PRNP

Humanos

1986

Mutações no gene da PrP, PRNP

Encefalopatia

Bovinos

1986

Infecção através da ingestão

Espongiforme Bovina

de ração contendo restos de

(BSE)

animais contaminados

Enfefalopatia Espongiforme

Felinos

1990

Felina Doença de Creutzfeldt-

Infecção pela ingestão de alimentos contaminados

Humanos

Jakob Variante (vCJD)

1995

Infecção pela ingestão de carne bovina contaminada

Adaptada (MABBOTT; MACPHERSON, 2006).

Durante muitos anos, buscou-se isolar e caracterizar o agente infeccioso dessas doenças, que não apresenta evidências de ser um microrganismo vivo, como bactérias ou vírus. Após muitos esforços, somente em 1967 (GRIFFITH, 1967) foi proposto que esse agente era uma proteína, descrevendo um novo paradigma dentro da biologia, a capacidade uma partícula proteica de auto propagar-se e espalhar-se ao longo do tecido nervoso. Além disso, essa proteína, surpreendentemente, apresenta propriedade 28

infecciosa, sendo capaz de ser transmitida entre um organismo portador da doença para um outro organismo saudável, através da inoculação, por exemplo, de extrato de cérebro de um organismo infectado com a doença em um organismo saudável, fazendo com que este adquira e desenvolva a doença (BÜELER et al., 1993). O agente causador das EETs foi chamado de ‘prion’ por Stanley Prusiner em 1982, cujo nome é um anagrama de ‘pro in’ derivado de ‘proteinaceous infectious particle’, termo que denominava uma partícula proteica infecciosa, que não apresentava evidências de conter ácidos nucleicos, por ser extremamente resistente à inativação por radiação ultravioleta (PRUSINER, 1982). Os estudos de Prusiner lhe renderam o prêmio Nobel de Medicina em 1997. O prion se mostrou altamente resistente a diversos procedimentos agressivos como o calor do cozimento normal dos alimentos, o congelamento, ao ressecamento, à pasteurização e à esterilização por radiação (MCKINLEY; BOLTON; PRUSINER, 1983). Uma característica marcante das EETs é a neurodegeneração em forma de vacúolos, processo conhecido como espongiose, que confere um aspecto esponjoso ao cérebro dos organismos infectados, além do crescimento anormal de astrócitos (gliose astrocítica) no tecido nervoso (PRUSINER, 1987). Em geral, os vacúolos encontram-se colocalizados com agregados da PrP (FIGURA 4). Existe uma variabilidade na manifestação dos sintomas clínicos e na intensidade deles observados entre as diferentes EETs, que podem variar no tempo de incubação da doença e nas diferentes regiões do cérebro em que se acumulam os agregados dessa proteína. Em geral, os indivíduos infectados apresentam sintomas clínicos de distúrbios do controle motor (ataxia), mioclonia (contração involuntária), distúrbios psíquicos, como a demência, parestesia (alterações na sensibilidade) e disfunções cognitivas, como alterações na memória e aprendizado, além de outras alterações comportamentais (DORMONT, 2002). Essas doenças apresentam um longo período de incubação, que podem variar de 1,5 a 40 anos e os pacientes evoluem ao óbito geralmente após um ano do aparecimento dos primeiros sintomas (PARCHI et al., 2011).

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FIGURA 4. Características histopatológicas das EETs. As doenças por prion, como a CJD em humanos, são caracterizadas pelo acúmulo difuso de agregados insolúveis da proteína prion celular (PrPC) enovelada na conformação anormal (PrPSc) no cérebro. Cortes histológicos da região cortical de cérebro humano foram corados por hematoxilina-eosina (H.E) e marcados com anticorpos contra a proteína ácida fibrilar glial (coluna GFAP), e contra a proteína prion (coluna PrP). Na coluna H-E por comparação com o controle é possível evidenciar a neurodegeneração em forma de vacúolos. As análises imunohistoquímicas mostram o crescimento anormal de astrócitos (marcação com GFAP) e o acúmulo de PrP, marcada com anticorpo específico Figura adaptada (AGUZZI, 2009).

As EETs podem ser de origem mutacional, infecciosa ou esporádica, mas todas envolvem modificações na estrutura da PrP (PRUSINER, 1998) (TABELA 2). Apesar de serem reportadas estas três origens, a grande maioria dessas doenças ocorrem de forma esporádica, sem apresentar modificações no gene que codifica para a PrP (PRNP) e sua causa ainda permanece desconhecida pela comunidade científica. A menor percentagem ocorre devido à exposição ao material infectado, principalmente de maneira iatrogênica, ou seja, causada acidentalmente durante procedimentos cirúrgicos como, por exemplo, um transplante de córnea derivado de um enxerto de um paciente sofrendo de sCJD (HECKMANN et al., 1997) ou, até mesmo, através do recebimento de hormônios de crescimento humano (GH) retirado da glândula pituitária de cadáveres (MARZEWSKI et al., 1988). Cerca de 5 a 15% dos casos de CJD são de origem genética, causados devido a mutações no gene da PRNP em células de linhagem germinativa. A doença em bovinos (EBB) ficou popularmente conhecida com a doença da ‘vaca louca’ devido ao comportamento descontrolado e agressivo apresentado pelos animais acometidos. A EEB dizimou milhares de cabeças de gados em alguns países da 30

Europa, afetando significativamente a economia local em meados de 1990 e despertou o pânico da população já que uma variante dessa doença em humanos, chamada doença de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD), teve seu primeiro caso descrito em 1996. Grandes evidências neuropatológicas, bioquímicas e epidemiológicas, como estudos de transmissão interespécies, levou a comunidade científica a acreditar fortemente que esta variante foi transmitida aos humanos através da ingestão de carne bovina contaminada de animais que sofriam de EEB (BRUCE et al., 1997; SCOTT et al., 1999). Essas evidências foram alarmantes, já que normalmente existe uma barreira de espécies entre as EETs, que impede que esse tipo de transmissão interespécie ocorra. Recentemente, foi visto que por transfusão de sangue de indivíduos sofrendo de vCJD era possível contaminar indivíduos sadios (ANDRÉOLETTI et al., 2012). Compreender os mecanismos de agregação da PrP, que estão envolvidos com a aquisição de suas características transmissíveis e infecciosas é fundamental para seja possível propor novas abordagens terapêuticas contra essas doenças que, até hoje, se apresentam invariavelmente fatais.

1.4. Propagação de prions

Durante muitos anos, acreditou-se que a propriedade de uma proteína mal formada de se autopropagar entre as células vizinhas, através de um mecanismo de conversão e transmissão que será melhor detalhado nos tópicos seguintes, era exclusivo da PrP. Entretanto, hoje em dia, muitos estudos vêm apontando para a capacidade de outras proteínas propensas à agregação e envolvidas em doenças neurodegenerativas, de também sofrerem propagação entre as células vizinhas, em um fenômeno que ficou conhecido como priônico ou do ‘tipo prion’. Nesse contexto, podemos citar o peptídeo βamiloide nas doenças de Alzheimer, a proteína α-sinucleína na doença de Parkinson, e a proteína huntingtina na doença de Huntington (FRITSCHI et al., 2014; PEARCE et al., 2015; SCHIERA; DI LIEGRO; DI LIEGRO, 2015). Cada uma dessas proteínas, quando mal enoveladas, podem agregar e se depositar nos tecidos na forma de placas intracelulares ou extracelulares, e com o tempo serem dissociadas desses agregados proteicos em que se encontram e serem transmitidas para as células vizinhas, forçando o mal enovelamento e agregação da respectiva proteína normal lá encontrada. Acredita-se 31

que muitas doenças neurodegenerativas, incluindo as citadas acima, evoluam dessa maneira e que os mecanismos de transferência célula-célula desses agregados podem se tornar alvos terapêuticos promissores (BRETTSCHNEIDER et al., 2015). Muitos estudos mostram que agregados amiloides podem sofrer internalização por células de mamíferos em cultura e se difundirem ao longo do tecido (DOMERT et al., 2014; NATH et al., 2012). Foi visto que a produção e o espalhamento de agregados do peptídeo β-amiloide pode ser alcançado em modelos de camundongos transgênicos, que expressam a proteína precursora amiloide humana, através da inoculação de extrato de cérebro de um paciente com a doença de Alzheimer (KANE et al., 2000; MEYERLUEHMANN et al., 2006). O acúmulo do peptídeo agregado não ficou restrito ao local de inoculação, mas foi capaz de ser difundido ao longo do tecido para outras regiões específicas (MEYER-LUEHMANN et al., 2006). Além disso, agregados sintéticos desse mesmo peptídeo produzidos in vitro também eram capazes de acelerar a doença nesses camundongos transgênicos após a infusão intracerebral (MORALES et al., 2012; STÖHR et al., 2012). Foi visto também nos pacientes com a doença de Parkinson, que receberam um enxerto de cérebro com tecido fetal saudável como estratégia de terapia, a formação de corpos de Lewy - ricos em agregados da α-sinucleína - no tecido enxertado. Essa evidencia mostrou que α-sinucleína mal formada era capaz de se difundir para células vizinhas saudáveis e agir como molde na conversão da estrutura da proteína nativa para uma estrutura patogênica com alta tendência a agregação (LI et al., 2008). A inoculação de agregados sintéticos da proteína α-sinucleína no córtex cerebral de modelos de camundongos transgênicos, que expressam a α-sinucleína humana com a mutação A53T (relacionada com a forma genética da doença de Parkinson) também eram capazes de se espalhar para diferentes regiões anatomicamente interconectadas (LUK et al., 2012). A difusão e acúmulo desses agregados se mostrou tóxica e promoveu a degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos da substância nigra, diminuição dos níveis de dopamina, e prejuízo nas habilidades motoras, manifestações clássicas da doença de Parkinson (LUK et al., 2012). Esses resultados tiveram alto impacto para a comunidade científica e estabeleceram que outras doenças conformacionais podem obedecer a um complexo modelo de propagação onde a penetração de ‘sementes’ mal enoveladas da proteína na célula hospedeira inicia processos de agregação e difusão espacial que causarão a progressão da doença (BRETTSCHNEIDER et al., 2015). Dessa forma, o mecanismo de 32

patogênese da PrP parece ser mais ubíquo do que se pensava, e pode deixar de ser a exceção para tornar-se um fenômeno comum em muitas doenças conformacionais (WALKER; JUCKER, 2015). Entretanto, é importante ressaltar que as formas patogênicas da PrP são as únicas que preenchem todos os requisitos para serem incluídas como uma classe especial de patógenos, como a capacidade de serem transmitidas entre indivíduos, e de serem avaliadas com técnicas microbiológicas como, por exemplo, a determinação de título infeccioso. Ainda que certas proteínas pareçam capazes de ‘infectar’ células vizinhas, elas não se propagam dentro de uma comunidade e nenhuma delas causaram epidemias, como o Kuru, que dizimou a tribo indígena na Papua Nova Guiné em 1990 através de rituais antropofágicos, e a EEB que dizimou milhares de gados na Europa por ingestão de rações contaminadas (GOLDFARB, 2002; PRUSINER, 1997).

1.5. A proteína prion

A proteína prion celular (PrPC) é uma glicoproteína de superfície, constituinte normal da membrana plasmática das células de mamíferos, altamente conservada entre diferentes espécies, sendo expressa em diversos tecidos, mas com maior abundância no sistema nervoso central, no tecido linfático e em junções neuromusculares (PRUSINER, 1998). Em sua estrutura madura a PrP humana apresenta cerca de 209 aminoácidos e se encontra normalmente ancorada à membrana celular através de uma âncora de glicosil fosfatidil inositol (GPI) a partir de sua porção carbóxi-terminal (PRUSINER, 1998; STAHL et al., 1987). Em geral, a proteína apresenta dois sítios de glicosilação nos resíduos de asparagina 181 e 197, mas a quantidade e a estrutura desses açúcares podem variar bastante entre diferentes cepas de prion (RUDD et al., 2002). A PrPC está normalmente ancorada à membrana celular, porém outras topologias menos recorrentes já foram identificadas, como a PrP intermembranar e citoplasmática (AGUZZI; STEELE, 2009). Estudos estruturais de alta resolução como RMN e cristalografia por difração de raio-X permitiram a caracterização estrutural fina da PrPC, que apresenta dois domínios bem distintos: uma cauda flexível, desenovelada na região N-terminal e um domínio C33

terminal globular compacto composto por três alfa-hélices e uma pequena folha-beta antiparalela (KNAUS et al., 2001; RIEK et al., 1996). Uma ponte dissulfeto é encontrada entre os resíduos de cisteína 179 e 214 conectando as hélices H2 e H3 (FIGURA 5) (CALZOLAI et al., 2000).

FIGURA 5. Proteína Prion. (A) Precursor da proteína prion de camundongo. A forma nativa compreende os resíduos 23 a 231. Sequências sinais estão presentes nas porções amino-terminal (1-22), que correspondem ao endereçamento da proteína para a membrana plasmática, e Cterminal (231-254) que determina a ligação à âncora de glicosil fosfatidil inositol (GPI). Os resíduos marcados (C178 e C213) representam a ponte de enxofre. (Retirado de http://www.chemosc.org). (B) Estrutura em alta resolução da proteína prion de camundongo (PDB 1AG2). (C) Estrutura da PrP humana (HuPrP 90-230) diglicosilada e ligada à uma bicamada de POPC através da âncora de GPI. Figura adaptada (DEMARCO; DAGGETT, 2005).

Animais nocaute para PrP, que não possuem o gene que codifica essa proteína, têm sido amplamente utilizados nos estudos para desvendar o papel fisiológico da PrPC. No entanto, esses animais, aparentemente, tiveram um desenvolvimento sadio e em sua sobrevida não apresentaram alterações em relação aos camundongos normais (BÜELER et al., 1992). Alguns estudos pontuaram pequenas alterações fenotípicas nesses animais, como déficit de aprendizado e alterações no ritmo circadiano (WEISSMANN; 34

FLECHSIG, 2003), disfunção olfativa (LE PICHON et al., 2008), aumento da excitabilidade na região hipocampal (MALLUCCI et al., 2002) e desmielinização de neurônios (BREMER et al., 2010). Acredita-se que outras proteínas com funções semelhantes a da PrP possam estar sendo super-expressas para compensar a ausência da PrP (MOORE et al., 1999). Com a intensificação dos estudos nessa área, atualmente muitas funções vêm sendo atribuídas à PrPC, como metabolismo de cobre e ferro, a regulação do sistema imune, transdução de sinal, processamento de ácidos nucleicos, modulação da atividade sináptica, proteção celular contra o estresse oxidativo e proteção contra a apoptose (revisto em LINDEN; CORDEIRO; LIMA, 2012). Como a PrP é capaz de se ligar a diferente moléculas na superfície da célula e de interagir com proteínas transmembranares, ativando diferentes vias de sinalização, alguns autores vêm sugerindo que essa proteína atue como uma plataforma de interação, aproximando diferentes proteínas e outras moléculas para formação de uma estrutura macromolecular que permitirá, então, que um sinal extracelular seja transmitido para o espaço intracelular, e, portanto, atuaria como uma proteína alostérica acessória da sinalização (LINDEN; CORDEIRO; LIMA, 2012). De fato, muitas moléculas se mostraram capazes de se ligar a PrP, elas estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, incluindo os citados acima, mas a importância biológica da maioria dessas interações continua desconhecida e podem, inclusive, estar envolvidas na sua patogenia. Uma outra possível função que merece destaque envolve o metabolismo e transporte de cobre, já que a PrP apresenta sítios de ligação de alta afinidade a cobre na região entre os aminoácidos 51 a 91 (THOMPSETT et al., 2005). Essa região é altamente conservada entre as espécies e apresenta um segmento de oito aminoácidos (PHGGGWGQ) que se repete ao longo desse domínio sendo capaz de coordenar íons cobre (Cu+2) fisiologicamente através de seus resíduos de histidina (BROWN et al., 1997). Além deste domínio, os resíduos de histidina 96 e 111 também foram identificados como ligantes de Cu2+ fora da região octamérica (WALTER et al., 2009). Em modelos animais de estudos com doenças por prions foi detectado alterações nos níveis celulares normais de cobre após a infecção por prion e a progressão da doença foi retardada com o uso de quelantes de cobre como forma de tratamento para essas doenças (SIGURDSSON et al., 2003). Foi visto também que neurônios em cultura são capazes de sequestrar Cu2+ da membrana plasmática em concentrações ditadas pelo nível da expressão de PrPC 35

(RACHIDI et al., 2003). Acredita-se que PrPC possa estar na maior parte do tempo ligada a esse íon bivalente que pode alterar sua conformação (QIN et al., 2000), dificultando ou facilitando a interação com um próximo ligante como moléculas de ácidos nucleicos (CHAVES et al., 2014).

1.6. Conversão estrutural da PrP

O evento central da patogênese das EETs é atribuído à conversão estrutural da PrPC em uma conformação anormal e infecciosa, chamada PrP scrapie (PrPSc). Essa interconversão estrutural promove grandes mudanças nas propriedades bioquímicas e biofísicas da proteína e está associada com a aquisição do seu caráter patogênico e infeccioso. Enquanto a PrPC apresenta uma conformação rica em α-hélice, é solúvel e sensível a digestão por proteases, a PrPSc é insolúvel, com alta propensão a formar agregados que são parcialmente resistentes à proteólise, o que levou a alguns autores a denomina-la como PrPRES. A forma scrapie pode formar agregados amiloides ou amorfos, que são capazes de se espalhar e de se acumular ao longo do tecido, promovendo a neurodegeneração (PAN et al., 1993; PRUSINER, 1998). Devido a essa alta tendência a agregação, a determinação estrutural da PrPSc por técnicas de alta resolução ainda permanece um grande desafio para os pesquisadores da área. Alguns modelos interessantes foram elaborados baseados em estudos de espectroscopia, microscopia eletrônica, difração de raio-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo, troca Hidrogênio/Deutério, e cristalografia eletrônica (REQUENA; WILLE, 2014; WILLE et al., 2002) (FIGURA 6). Os primeiros estudos baseados em modelagem molecular sugerem que a formação da PrPSc ocorra através do reenovelamento em folhas-β dos resíduos presentes na região 90 a 140 (HUANG; PRUSINER; COHEN, 1996). Já foi visto também que a região flexível desestruturada da PrP pode assumir um enovelamento em folhas-β (GOVAERTS et al., 2004). Um estudo recente de RMN em estado sólido analisou a estrutura fibrilar amiloide da PrP produzida em laboratório e propuserem que alguns aminoácidos da região C-terminal contendo a hélice 2 e hélice 3 se reenovelem em uma arquitetura de folhas-beta paralelas intermoleculares (GROVEMAN et al., 2014). Diferentes modelos moleculares foram usados para predizer a estrutura da PrPSc, mas o uso de diferentes abordagens de 36

modelagem resultou em soluções estruturais significativamente divergentes. O desacordo entre as diferentes soluções de modelagem mostra a limitação dessa técnica e muitos modelos atuais contradizem uns aos outros (REQUENA; WILLE, 2014). Ainda há muito debate na literatura se as estruturas resultantes de agregados sintéticos realmente representam a forma infecciosa da PrP formada in vivo. Dessa maneira, o modelo estrutural da PrPSc ainda é um convite aberto para aqueles que desejam dedicar mais esforços em superar essas dificuldades.

FIGURA 6. Estrutura e conversão da proteína prion. (A) Modelo beta helicoidal propõe um re-enovelamento na região N-terminal nos resíduos 90-177 (verde claro), com a região Cterminal, resíduos 178-230 (verde escuro), mantendo sua estrutura em alfa hélice intacta. (B) O modelo espiral consiste em um núcleo espiral que compreende pequenas folhas-beta e mantém as alfa-hélices da PrPC nativa. (C) O modelo folha-beta estendida propõe uma mudança conformacional total na estrutura da PrPC, que assume uma conformação formada exclusivamente por folhas beta. Retirado de (DIAZ-ESPINOZA; SOTO, 2012).

É importante lembrar que a sequência primária da forma celular e da forma scrapie é a mesma, excetuando-se a minoria dos casos que são de origem mutacional, portanto sabemos que a conversão entre essas duas formas não é causada por modificações covalentes nessa proteína, mas sim por profundas modificações conformacionais, como ficou evidenciado em diversos estudos espectroscópicos, como dicroísmo circular (CD) e infravermelho (IR). Esses estudos mostraram que a PrPC é convertida em PrPSc através 37

de um processo pós-traducional, no qual parte de sua estrutura em α-hélices e o seu entorno é reenovelada em folhas-β (CAUGHEY et al., 1991; PAN et al., 1993). Muitos esforços foram dedicados para tentar compreender o mecanismo de conversão estrutural da PrP. O principal modelo proposto é conhecido como ‘conversão assistida por molde’ e sugere que a estrutura da PrPSc atue como um molde molecular, induzindo a forma PrPC a se reenovelar da maneira incorreta, promovendo a propagação da PrPSc num ciclo autocatalítico onde a PrPC é o substrato da reação de conversão (FIGURA7) (AGUZZI; LAKKARAJU, 2016). Um segundo modelo propõe a polimerização mediada por semente e sugere que as duas formas (PrPC e PrPSc) coexistam em equilíbrio termodinâmico, e somente um desvio para maior produção da PrPSc poderiam lentamente formar sementes capazes de recrutar formas monoméricas da PrPC para conversão e formação de agregados maiores. De qualquer maneira, os dois modelos propõem a indução da alteração conformacional, mas a etapa limitante desse segundo mecanismo seria a formação de uma semente competente para conversão e agregação, e não o evento de conversão isoladamente (FIGURA 7). Os agregados maiores formados poderiam sofrer fragmentação, gerando novas sementes capazes de iniciar a formação de novos agregados. Atualmente, esse fenômeno de conversão que ficou conhecido como conversão do tipo prion pode ser atribuída a outras proteínas mal formadas envolvidas em doenças neurodegenerativas (WALKER; JUCKER, 2015). É importante ressaltar que existe uma grande barreira energética prevenindo a conversão espontânea da PrPC em PrPSc, o que nos sugere que a presença de um cofator, de natureza molecular ainda desconhecida, poderia auxiliar essa conversão, reduzindo essa barreira, atuando como uma espécie de catalisador (CAUGHEY; KOCISKO, 2003; CORDEIRO et al., 2001; SILVA et al., 2008; VIEIRA et al., 2011)

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FIGURA 7. Modelo proposto para a conversão do PrPC em PrPSc. (A) Modelo de conversão assistida por molde. A conversão é cineticamente controlada, uma barreira energética elevada previne a conversão espontânea. A interação com PrPSc introduzida de fonte exógena provocaria uma mudança conformacional na PrPC. (B) Nucleação mediada por semente. A formação de PrPC e PrPSc coexistem, com o equilíbrio fortemente favorecido para PrPC. A formação da semente é rara, no entanto, uma vez presente, a semente recruta monômeros de PrPC rapidamente para conversão. Para explicar a conversão exponencial, os agregados devem ser continuamente fragmentados gerando quantidades crescentes de sementes. Adaptada de (AGUZZI; LAKKARAJU, 2016).

As bases moleculares da conversão permanecem ainda inconclusivas e, por isso, são alvo constante de estudos entre os pesquisadores da área. O que se sabe, de fato, é que a infecção e progressão de doença só ocorre se a PrPC está sendo expressa no organismo (BÜELER et al., 1993). A inoculação intracerebral de extrato de cérebro de camundongos infectados com a forma scrapie em camundongos saudáveis se mostrou transmissível, levando ao surgimento da doença, em contrapartida, se a inoculação fosse realizada em camundongos nocautes para PrP, esses animais se tornavam resistentes à infecção (BÜELER et al., 1992, 1993). Abordagens terapêuticas que tinham como objetivo o silenciamento da expressão gênica da PrPC em neurônios foi capaz de

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prolongar a sobrevivência e recuperar algumas das funções em modelos de camundongos infectados (WHITE et al., 2008)

1.7. Cepas de prions

Apesar dos estudos inicias sobre as EETs apontarem como o agente etiológico dessas doenças uma molécula de natureza inteiramente proteica, sem evidências de conter ácidos nucleicos, ainda não se sabe o que faz com que essa proteína adquira esse caráter infeccioso, por que diferentes fenótipos da doença podem ser deflagrados pela mesma proteína malformada e, ainda, se a presença de outros fatores celulares, além da PrPC sejam necessários para estimular eficientemente a produção de PrPSc. Uma tentativa para explicar essa diversidade fenotípica é a proposta de que existam múltiplos estados conformacionais estáveis auto-replicantes da PrPSc, conhecido como cepas de prions. De fato, a espectroscopia de infravermelho e outros ensaios bioquímicos revelaram diferentes estruturas para a PrPSc quando isolada de cérebro de animais infectados com diferentes cepas de prions (SAFAR et al., 1998; THOMZIG et al., 2004). Acredita-se que a estrutura da PrPSc compartilha um padrão de enovelamento entre as diferentes cepas, e que as diferenças cepas-específicas dos confôrmeros das PrPSc sejam relativamente pequenas, mas suficiente para gerar agregados com propriedades físico-químicas diferentes, como diferente resistência a proteólise, e desencadear doenças com fenótipos distintos, como diferentes tempos de incubação e seletividade para regiões de propagação e acúmulo no cérebro (FIGURA 8) (COLLINGE, 2010; HECKER et al., 1992). Os diferentes agregados da PrPSc possuem propensões distintas a sofrer fragmentação e gerar novas sementes e, por isso, especula-se que esse seja um dos principais motivos que determinar seu impacto sobre a fisiologia celular (TANAKA et al., 2006). Foi visto também que as cepas podem ser secretadas de maneira diferente pela célula e isso pode alterar seu espalhamento ao longo do tecido nervoso (ARELLANOANAYA et al., 2015).

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FIGURA 8. Modelos de cepas de prion. A transmissão de diferentes cepas de prions para hospedeiros geneticamente idênticos resulta em fenótipos distintos, com períodos de incubação e perfis de lesão diferentes. Essas características persistem nas passagens para novos hospedeiros. As diferentes cepas podem apresentar características bioquímicas distintas, como mobilidade eletroforética e padrão de resistência à PK (como ilustrado na figura pela imagem do gel de eletroforese marcado com anticorpo anti-PrP por Western Blot). Acredita-se que essas diferenças sejam resultantes dos múltiplos estados conformacionais que podem ser adotados pelas diferentes cepas, o que leva à exposição de diferentes locais para clivagem enzimática (ilustrada pelas tesouras). Figura retirada de (AGUZZI; HEIKENWALDER; POLYMENIDOU, 2007) (Aguzzi, Heikenwalder and Polymenidou, 2007).

A existência de diferentes cepas de prions pode estar associada a barreira de espécie que normalmente impede que a forma infecciosa da doença seja transmitida para indivíduos de espécies diferentes. Sugere-se que essa barreira seja mantida por alguns fatores, como a diferença entre as sequências primária e terciária da PrP do doador e do hospedeiro ou ainda devido a um parceiro molecular específico de natureza ainda desconhecida (cofator da conversão) presente naquele organismo. Esse fator seria capaz de interagir com a PrP celular e facilitar sua conversão para a forma anormal e infecciosa (KANEKO et al., 1997; TELLING et al., 1995).

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1.8. Prions sintéticos

O longo período de incubação das doenças por prions, que pode variar entre as diferentes cepas infecciosas, junto com evidencias mais recentes de que algumas conformações da PrP podem se propagar silenciosamente, ou seja, sem manifestarem os sintomas clássicos das doenças (KLIMOVA; MAKARAVA; BASKAKOV, 2015), nos sugere que o espalhamento de outras proteínas mal formadas dentro de um organismo ou até mesmo a sua transmissão para um próximo pode estar sendo apenas indetectável dentro de uma escala de tempo compatível com a vida desse organismo, mas que pode sim estar acontecendo. Talvez essas diferenças cinéticas expliquem porque recentemente muitos estudos vêm mostrando que diversas proteínas ou peptídeos amiloides apesar de serem capazes de se propagar para as células vizinhas, num fenômeno do tipo prion e estarem envolvidos em outras doenças conformacionais, até hoje, nenhuma delas se mostrou infecciosa dentro de uma comunidade (WALKER; JUCKER, 2015). Até hoje, não sabemos que estados autorreplicantes são potencialmente patogênicos e quais as características estruturais que separam os estados autorreplicantes infecciosos dos aparentemente inócuos. Muitos esforços têm sido dedicados na tentativa de produzir a forma autorreplicante e infecciosa in vitro a partir da PrP recombinante na ausência de cofatores celulares (BASKAKOV et al., 2002; BOCHAROVA et al., 2005). Essas formas são chamadas de prions sintéticos, uma vez que são produzidas dentro do laboratório. Apesar de muitos pesquisadores terem conseguido gerar agregados da PrP com características clássicas da forma scrapie, com estrutura semelhante rica em folhas-β, resistência à digestão por proteases e com a capacidade inerente de se autopropagar, eles geralmente não eram capazes de promover sozinhos a infecção com progressão da doença em animais normais (CHESEBRO et al., 2005; HILL; ANTONIOU; COLLINGE, 1999; PICCARDO et al., 2007). Alguns estados conformacionais da PrP de natureza amiloide foram capazes de se propagar no cérebro e de serem transmitidos serialmente de um animal para outro em condições laboratoriais, entretanto, apesar de transmissíveis, eles não se apresentaram tóxicas e tampouco manifestaram sinais clínicos de doenças por prions nesses animais. Exemplos desses casos incluem a transmissão de agregados amiloides da PrP em 42

camundongos transgênicos da PrP, com a mutação P101L, induzidas pela exposição a material biológico de pacientes sofrendo de GSS com a mutação P102L (PICCARDO et al., 2007); e formas resistentes à proteólise (PrPRES), que se disseminaram ao longo do tecido nervoso nos animais inoculados com fibras da PrP produzidas em laboratório em ensaios livres de células (KOVACS ET AL., 2013; MAKARAVA ET AL., 2011B). A falta da característica patogênica infecciosa indicava que algo estava faltando na geração dessas partículas in vitro para que fosse preenchido todos os requisitos necessários para serem consideradas como prions ‘verdadeiros’. De fato, alguns pesquisadores conseguiram produzir estruturas da PrP, que retém a propriedade infecciosa, capazes de gerar doenças em camundongos saudáveis, entretanto esses prions sintéticos foram formados e propagados na presença de outras moléculas acessórias, como ácidos nucleicos e lipídeos, que foram consideradas por esses pesquisadores como os componentes mínimos necessários para produção de ‘verdadeiros’ prions in vitro (DELEAULT et al., 2007).

1.9. Cofatores da conversão

Ao longo de 20 anos, os estudos com a PrP vêm mostrando que essa proteína é capaz de se ligar a diferentes classes de macromoléculas biológicas, como proteínas da matriz extracelular (SANTUCCIONE et al., 2005), lipídeos (WANG et al., 2007), glicosaminoglicanos (VIEIRA et al., 2011) e moléculas de ácido nucleico (CORDEIRO et al., 2001; GOMES et al., 2008; MACEDO et al., 2012). Em geral, a maioria dessas interações promovem mudanças na estrutura da proteína, e, assim como podem estar envolvidas com a sua função fisiológica, podem favorecer também o processo patogênico. Devido a existência de uma alta barreira energética que impede que conversão espontânea entre PrPC-PrPSc ocorra, por ser um processo termodinamicamente desfavorável, foi proposto a hipótese de cofatores moleculares que poderiam auxiliar o processo de interconversão estrutural da PrP (CORDEIRO; SILVA, 2005; SUPATTAPONE, 2014) (FIGURA 8).

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FIGURA 8. Diagrama de energia livre representando o papel de cofatores na conversão estrutural da PrP. PrPC (esquerda) pode enovelar para uma forma mal enovelada rica em folhasβ capaz de formar agregados tóxicos e infecciosos (PrPSc) (direita). A transição entre as espécies é separada por uma grande barreira energética. I e U representam os estágios intermediários do enovelamento e a forma desenovelada da PrP, respectivamente. Um fator adjuvante, como moléculas de ácidos nucleicos, lipídeos ou glicosaminoglicanos reduziria a barreira de energia livre que previne a conversão, levando a formação de PrPSc. Diferentes cofatores podem estimular a conversão para diferentes conformações patogênicas da PrPSc, provendo uma possível explicação para diversidade estrutural de diferentes cepas de prions. (SILVA; CORDEIRO, 2016).

O ambiente específico de replicação, incluindo os fatores celulares ali presentes e as modificações pós-traducionais, podem guiar a PrP a adquirir e manter um determinado estado conformacional autorreplicante. Após mudanças no ambiente de replicação, um estado conformacional pode se adaptar a esse novo local e dar origem a outras conformações alternativas que se adaptem melhor nesse novo ambiente, podendo tornarse ainda mais agressivas no que diz respeito a sua patogenia, fato que tem sido constantemente observado durante a inoculação de segunda passagem de agregados de prion produzidas em laboratórios (DELEAULT et al., 2012; WANG et al., 2010). Quando o extrato de cérebro de um primeiro animal inoculado com prion sintético é usado para infectar um segundo animal saudável, o efeito da segunda passagem é quase sempre mais sintomático e debilitante (COLLINGE; CLARKE, 2007). A explicação desse fato pode estar relacionada à presença de fatores celulares adjuvantes do processo de conversão presente no cérebro do primeiro camundongo infectado que facilitariam a formação de 44

estruturas anômalas mais tóxicas e mais infecciosas para uma segunda infecção em outro animal (DELEAULT et al., 2012). Juntos, essas evidências fortalecem a hipótese de que cofatores da conversão podem auxiliar na patogênese de PrP. Com o desenvolvimento da técnica “Protein Misfolding Cyclic Amplification” (PMCA), que consiste na incubação de pequenas amostras de PrPSc (advindas de extrato de cérebro de camundongos infectados) com um excesso de PrPC (advindo de homogenatos de cérebro saudável), foi possível propor um modelo de conversão e propagação da PrP in vitro (SABORIO; PERMANNE; SOTO, 2001). A fragmentação por ultrassom de agregados da PrPSc gera sementes que são capazes de induzir a conversão da PrPC a uma forma resistente a digestão por proteases (PrPRES), amplificando-a em cerca de 6 vezes (LUCASSEN; NISHINA; SUPATTAPONE, 2003; SABORIO; PERMANNE; SOTO, 2001). Nesse ensaio livre de células, foi possível mimetizar a replicação priônica, mas era necessário um excesso molar de 50 vezes da forma normal da PrPC para que a conversão ocorresse, sugerindo que esse processo possa depender da presença de outros fatores além da PrPC para ocorrer de maneira mais eficiente (CAUGHEY et al., 1999) e tais fatores devem estar presentes nos homogenatos. Mais recentemente, o desenvolvimento da técnica de Real-time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) permitiu estudar a conversão da PrP de maneira mais rápida e eficiente (ATARASHI et al., 2011). Nessa técnica, a forma recombinante da PrP é utilizada como substrato e o extrato de cérebro infectado é a semente de conversão para PrPSc e, ao invés de pulsos de ultrassom típicos da técnica de PMCA, é utilizada uma constante agitação para garantir a dissociação dos agregados. Os agregados formados na reação de conversão possuem características amiloides, e, portanto, podem ser detectados em tempo real através do monitoramento da fluorescência da sonda ThT (ATARASHI et al., 2011). Não sabemos em que extensão a conversão para uma forma resistente ou para uma estrutura amiloide, através do PMCA ou RT-QuIC, respectivamente, está intimamente relacionada com a forma scrapie, já que muitos produtos da reação de conversão in vitro não foram capazes de induzir as doenças em modelos de animais (KOVACS et al., 2013; MAKARAVA et al., 2011a). Essas técnicas revolucionaram os estudos de produção de prion sintético porque possibilitaram testar quais cofatores celulares podem estimular o evento de amplificação e produção eficiente de PrPSc.

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Nesse contexto, muitos estudos têm avaliados o papel de ácidos nucleicos como potentes cofatores moleculares da conversão da PrP. Foi visto que a PrP é capaz de se ligar a diferentes moléculas de DNA e RNA, tanto in vitro como in vivo (ADLER et al., 2003; CHAVES et al., 2014; CORDEIRO et al., 2001; DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003; GOMES; CORDEIRO; SILVA, 2008; MACEDO et al., 2012) e essa interação pode estar envolvida na patofisiologia da proteína. Os estudos de interação da PrP com ácidos nucleicos, a relevância biológica dessas interações, assim como, a introdução de uma metodologia para identificação de novas sequências de ácidos nucleicos, conhecidas como aptâmeros, que possuem alta afinidade e especificidade contra a PrP e o potencial terapêutico e de diagnóstico dessas moléculas serão abordados na seção de introdução ao primeiro capítulo desta tese que tem como um dos principais objetivos entender os mecanismos de interação, conversão e agregação da PrP na presença de ácidos nucleicos.

1.10. Terapia e diagnóstico das EETs

Apesar de inúmeras substâncias terem sido identificadas, não existe, até o momento, nenhuma terapia curativa ou paliativa para o tratamento das EETs. Em geral, essas substâncias falham em sua eficácia devido à incapacidade em atravessar a barreira hematoencefálica, ou por se apresentarem altamente tóxicas (CORDEIRO; FERREIRA, 2015). Diversas abordagens terapêuticas têm sido propostas a fim de encontrar um tratamento efetivo contra as EETs. A terapia curativa tem como alvo a erradicação da infecção priônica e a restauração das funções perdidas, através da eliminação da PrPSc e da reposição das células danificadas, respectivamente, porém parece que estamos longe de alcançar tal objetivo, já que até hoje não há evidências de que algum paciente ou animal experimental acometido pela doença tenha sido curado. Por isso, as intervenções paliativas são mais realistas, e visam desacelerar o ritmo de progressão da doença, o que poderia prolongar a sobrevivência e aumentar a qualidade de vida, no entanto sem 46

erradicar a doença. Nesses casos a maioria das abordagens terapêuticas é baseada no desenvolvimento de estratégias para controlar a conversão conformacional, aumentar o clearance da forma anormal e/ou impedir a agregação. Diversos compostos de diferentes classes químicas, assim como peptídeos e ácidos nucléicos já foram investigados por sua habilidade em impedir a agregação, ou propagação da PrP, diminuindo o ritmo de progressão da doença (REDDY e et al, 2006; CASHMAN e CAUGHEY, 2004). Entretanto, a maioria das substâncias que foram eficazes in vitro não aumentou a sobrevida e/ou melhorou os sintomas manifestados em modelos de animais doentes. Além da busca por terapias efetivas contra as EETs, é extremamente necessário o desenvolvimento em conjunto de novas metodologias que permitam um diagnóstico precoce dessas doenças e aumente, assim, as chances de sucesso de uma determinada intervenção terapêutica. Atualmente, o diagnóstico é feito com base em sinais clínicos e sintomáticos, não existindo métodos diagnósticos pré-sintomáticos. Portanto, a infecção por prions é tipicamente diagnosticada somente depois que a doença já progrediu consideravelmente. Por mais de três décadas, os métodos para o diagnóstico molecular das infecções por prions são baseados na detecção da PrPSc pela sua resistência à digestão por proteases (CRONIER et al, 2008). Como a PrPSc acumula-se em grande quantidade no cérebro, é necessário a obtenção de uma biópsia de tecido cerebral para a sua detecção; sendo assim, na grande maioria dos casos, um diagnóstico preciso se baseia em análise histopatológica post-mortem. Dessa forma, é prioritário o desenvolvimento de métodos de ensaio altamente sensíveis para a detecção bioquímica da PrPSc em tecidos e fluidos corporais tendo em vista que poderiam ser utilizados com o paciente vivo e antes de um grande avanço da doença. Vale destacar, que técnicas de conversão como PMCA e RTQuIC são promissoras porque podem propagar quantidades mínimas de PrPSc, que poderiam estar presentes em fluidos corporais, mas ainda não existe um protocolo implementado na clínica (HENDERSON et al., 2015).

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2. OBJETIVOS GERAIS

O principal objetivo desta tese é estudar os mecanismos de conversão e agregação da proteína prion (PrP) utilizando diferentes abordagens in vitro e in vivo, com o intuito de compreender as características fisiopatológicas dessa proteína, que serão apresentados em dois capítulos distintos. No primeiro capítulo, objetivamos determinar o papel de ácidos nucleicos na patogênese da PrP e selecionar, a partir de uma biblioteca com milhares de sequências de DNAs diferentes, novos oligonucleotídeos de alta afinidade e especificidade contra essa proteína. No segundo capítulo, objetivamos propor um modelo simples e eficiente de produção de agregados amiloides da PrP realizado in vivo dentro de células procarióticas e discutir o potencial desse sistema na compreensão da patogênese de prions.

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CAPÍTULO 1 – ESTUDOS DE INTERAÇÃO DA PROTEÍNA PRION COM ÁCIDOS NUCLEICOS

3. CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO

A interação entre a PrP e os ácidos nucleicos vem capturando a atenção dos pesquisadores nos últimos vinte anos. O primeiro estudo foi conduzido por Nandi em 1997 com o peptídeo neurotóxico da PrP derivado de humano, compreendendo os resíduos 106-126 (PrP106-126), onde ele mostrou, através de medidas de fluorescência, a habilidade desse peptídeo em ligar pequenas sequências de DNA com afinidade na faixa de micromolar, e que esta ligação era capaz de induzir mudanças estruturais na molécula do DNA (NANDI, 1997). Em publicações subsequentes, Nandi mostrou que a PrP106-126 era capaz de ser polimerizada em agregados amiloides na presença de DNA e que a forma selvagem (wild-type) da PrP inteira recombinante murina (rPrP) também sofria polimerização imediata em solução aquosa contendo DNA (NANDI, 1998; NANDI; LECLERC, 1999). Em 2001, nosso grupo mostrou pela primeira vez o duplo papel do DNA na modulação da agregação da rPrP. A interação da rPrP inteira com oligonucleotídeos de DNA de dupla fita (dsDNA) promovia a conversão estrutural e agregação da proteína, alterando sua conformação nativa rica em α-hélices para uma conformação similar a scrapie, rica em folhas-β (CORDEIRO et al., 2001). De forma interessante, a incubação com esses mesmos oligonucleotídeos eram capazes de inibir a agregação do peptídeo hidrofóbico da PrP compreendo os resíduos 109-149 (PrP109-149) (CORDEIRO et al., 2001). A PrP109-149 sofre agregação imediata quando diluído de uma condição desnaturante em uma solução aquosa, mas a agregação foi inibida em tampão aquoso contendo DNA, de maneira dependente da concentração de DNA (CORDEIRO e et al., 2001). Esses resultados levaram a proposta de que a molécula de DNA pode modular a conversão da PrP, alterando o equilíbrio entre as formas PrPC e PrPSc, reduzindo a mobilidade da proteína e favorecendo sua agregação (CORDEIRO; SILVA, 2005). Um importante conhecimento adquirido foi a identificação do sítio de ligação da PrP ao DNA, através de estudos de RMN e espectroscopia de raio-x a baixos ângulos (SAXS) foi sugerido pelo menos dois sítios de ligação de DNA na PrP; um deles no

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domínio C-terminal globular da proteína e o outro no domínio N-terminal desestruturado (FIGURA 9) (LIMA et al., 2006; MERCEY et al., 2006; WEISS et al., 1997).

FIGURA 9. Reconstrução tridimensional PrP121-231 a partir de medidas de SAXS. Sobreposição do envelope da PrP121-231 e da estrutura cristalográfica de um DNA de 16 pb (PDB: 2BOP) com o complexo PrP121-231:DNA. Retirada de (LIMA et al., 2006)

Seguindo essas observações iniciais, muitos outros grupos começaram a avaliar a ligação de ácidos nucleicos tanto com a PrPC como a PrPSc, desvendando muitas características resultantes dessa interação que dependendo das condições de interação podem gerar efeitos distintos (TABELA 3).

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Tabela 2. Propriedades de ligação de aptâmeros e outros NAs ligantes da PrP

Autor (ano)

Tipo de NA

KD (nM.L-1) Ensaio de ligação

Sítio(s) de Espécies de PrP ligação na reconhecidas PrP Camundongo, hamster, bovino (PrP em homogenato de cérebro) [23-36]

Weiss, 1997

RNAaptâmero

ND

Gel-shift

Nandi, 1997

Plasmídeo DNA

250

Deslocamento de sonda fluorescente Humana rPrP106-126

25

Polarização de fluorescência

Murina rPrP23-231

ND

Gel shift

Humana rPrP23-231 or

Cordeiro, 2001

Proske, 2002

dsDNAs HIV-1 LTR DNA (1000 pares de bases) HIV-1 5’leader RNA (415 bases) RNAaptâmero

100

Gel shift Ensaio de filtroligação

Adler, 2003

RNAs estruturados

3,8

Ensaio de filtroligação e Gel shift

Gabus, 2001 Gabus, 2001

Sayer, 2004

RNAaptâmero RNAaptâmero

Sekiya, 2005

RNAaptâmero

Rhie, 2003

Mercey, 2006

RNAaptâmero RNAaptâmero

Lima, 2006

dsDNAs

Takemura, 2006 Nishikawa, 2007 Berra, 2007

DNAaptâmero RNAaptâmero

Sekiya, 2006

Ogasawara, 2008

dsDNAs DNAaptâmero

ND

16 6,8

ND

Competição de ligação Ligação de equilíbrio

ND

ND N-terminal and Cterminal

23- 144

Humana rPrP23-231; Ovina rPrP25-234 Hasmter, camundongo e humano rPrP Humano rPrP, PrP de homogenato de cérebro de camundongo, rato e hamster Bovina rPrP na forma βoligomérica ou em a-hélice, SAF não tratado com PK e SAF+PK Bovina rPrP Murina rPrP23-231 e SAF de camundongo Murina rPrP23-231, bovina rPrP (23-231), PrP em homogenato de cérebro de camundongo Ovina rPrP, Murina rPrP, Bovina rPrP

N-terminal N-terminal [90 -129] N-terminal N-terminal e conformação de SAF em sítio especifico [110-230] ND [23-108] da PrP murina e SAF de camudongo

15

Ensaio de filtroligação SPR, Ensaio de filtro-ligação

90

Polarização de fluorescência

16

gel-shift, dotblot

ND

Bovina rPrP

ND

1100

ND Polarização de fluorescência

Murina rPrP23-231

N-terminal

100

SPR

Murina rPrP23-231

ND

5,6

Murina rPrP23-231 Murina rPrP23-231, PrP em homogenato de cérebro de ovelhas, porcos, bezerros e cervos; PrP não tratada com PK de células ScN2a

[23-108] e [23-88] [25-34] e [101-110] N-terminal and Cterminal

[23-89]

51

Murakami, 2008

Mashima, 2009

Wang, 2011

RNAaptâmero RNA Gquadruplex RNA Gquadruplex DNA Gquadruplex DNA Gquadruplex Aptâmero de DNA imobilizado

Macedo, 2012 dsDNAs DNA Gquadruplex RNA Gquadruplex Cavaliere, DNA G2013 quadruplex RNA Gquadruplex

31

SPR

8,5 280 85

Ensaio Northwestern blotting

> 280 22

Bovina PrPC Bovina amiloidogênica PrPβ Bovina PrPC Bovina amiloidogênica = PrP-β

[125-231] [25-34] and [110-118] ND [25-34] and [110-118] ND

Humana rPrP103-231 Murina rPrP23-231 and rPrP109-149

ND [90-231] e [109-149]

62

Ovina rPrP23-24

[23-134]

75

Ovina rPrP23-24

[23-134]

ND

300 400

SPR Medidadas de Fluorescência

Bovina rPrP23-231

SPR e ITC

Ovina amiloidogênica PrP-β ND Ovina amiloidogênica PrP-β ND

SPR - Ressonância de Plasmon de Superfície; ITC – Calorimetria por titulação isotérmica; SAF – fibras amiloides associadas a forma scrapie; ND – não determinado. A sequência de aminoácidos presente no sitio de ligação está apresentada entre colchetes.

Interações da PrP com RNA também vêm sendo frequentemente descritas. Pesquisadores mostraram que tanto a PrP humana quanto a ovina interagem com o RNA do vírus HIV-1, levando à formação de estruturas nucleoproteicas parecidas com proteínas nucleocapsídicas retrovirais (GABUS et al., 2001a). Esse mesmo grupo de pesquisa sugeriu que a PrP poderia atuar no metabolismo de ácido nucleico, sendo capaz de acelerar a hibridização de fitas de DNA complementar e atuar como chaperonas do DNA viral (GABUS et al., 2001b). Posteriormente, foi visto que a PrP oriunda de diferentes espécies era capaz de facilitar a troca da fita de DNA, direcionar a clivagem de um molde de RNA e promover o trans-splicing de RNA de uma maneira similar a proteína nucleocapsídica do HIV-1. De fato,

a rPrP pode ligar diferentes sequências de RNAs com alta finidade in vitro e in vivo, promovendo alterações na estrutura da proteína e formação de agregados, onde a PrP se torna resistente a digestão por proteases e o RNA ligado ao complexo se torna resistente ao ataque por ribonucleases (ADLER et al., 2003; DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003; GOMES et al., 2008; LIU et al., 2007). Diferentes trabalhos mostraram que a interação com RNA é normalmente abolida quando a PrP não apresenta a região N-terminal, evidenciando a importância dessa região em mediar a interação com RNA (ADLER et al., 2003; GOMES et al., 2008). Em 2003, foi descrito pela primeira 52

vez o papel de moléculas de RNA em estimular a conversão eficiente da PrP a partir da técnica de PMCA (DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003). Nesse trabalho foi visto que a presença de RNAse era capaz de inibir a amplificação da PrPres de maneira dose-dependente, mostrando que o RNA era necessário para a eficiente propagação da PrP. Além disso, foi verificado que somente a adição de RNAs específicos, isolados de cérebros de mamíferos, era capaz de reiniciar o processo de conversão (DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003). Trabalhos subsequentes, utilizando somente moléculas purificadas, revelaram que o conjunto PrPC, PrPSc, lipídeos copurificados e um poliânion sintético de RNA formavam o conjunto mínimo de componentes necessários para produção e amplificação de prions sintéticos capazes de infectar camundongos normais in vivo (DELEAULT et al., 2007). Nosso grupo mostrou, através de diversas técnicas espectroscópicas, que a extração de RNA de diferentes fontes, como células de mamíferos, fungos ou bactérias, podem estimular diferentemente a conversão e agregação de rPrP murina, e somente os agregados formados após incubação com RNA extraídos de células de neuroblastoma murino (N2a), eram potencialmente tóxicos para cultura de células N2a (GOMES et al., 2008). A necessidade aparente de uma molécula acessória negativamente carregada para eficiente produção de prions infecciosos in vitro apoia a hipótese dos cofatores, onde fatores endógenos ou extracelulares podem participar da propagação de prions in vivo. Entretanto, mais estudos são necessários para que sejam determinadas quais são as características moleculares para que um cofator seja considerado ‘perfeito’ para estimular a formação de prions. Nós mostramos previamente que duas sequências distintas de DNA ao interagir com a rPrP, provocam diferentes efeitos na agregação, estrutura e estabilidade da proteína e que os complexos rPrP:DNA formados apresentam diferentes perfil de toxicidade em linhagens celulares (MACEDO et al., 2012). A interação PrP e ácido nucleico pode gerar diferentes espécies agregadas e citotóxicas dependendo da sequência de ácido nucleico empregada, entretanto, ainda não fomos capazes de determinar quais padrões na molécula de ácido nucleico, como sequência, estrutura ou tamanho, são responsáveis por guiar a interação e ditar esses diferentes resultados, e nem se esses agregados apresentam propriedade infecciosa, sendo esses um dos grandes objetivos desta tese. Como a PrPC se encontra tipicamente ancorada a superfície da membrana plasmática das células, uma correlação entre a interação da PrP com ácidos nucleicos parece inusitada, entretanto, outras topologias da PrP já foram identificadas, com a 53

presença da PrPC no núcleo de células neuronais e endócrinas onde seriam capazes de interagir com elementos da cromatina (STROM et al., 2011). Foi reportado também a translocação e deposição de formas mal enoveladas da PrP no núcleo de células infectas por prions (MANGÉ et al., 2004). Entretanto, novas evidências da localização nuclear de PrP não foram mais reportadas. Não podemos descartar a ideia de que essas localizações atípicas da PrP podem contribuir para o seu encontro com parceiros moleculares nãonativos que podem estar envolvidos na sua patogênese. Nos últimos anos, interações aberrantes entre proteínas e ácidos nucleicos vêm sendo associadas também com outras doenças neurodegenerativas (CORDEIRO et al., 2014b; LIU; ZHANG, 2011). As evidências até agora apresentadas sugerem que tanto o DNA como o RNA podem atuar como cofatores da conversão da PrP. Ambos são capazes de alterar o enovelamento da proteína e promover sua agregação. Com o desenvolvimento da técnica de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) foi possível selecionar ácidos nucleicos que se liguem com alta afinidade e especificidade contra um determinado alvo molecular (ELLINGTON; SZOSTAK, 1990; TUERK; GOLD, 1990). Em geral, o processo de seleção ocorre em quatro etapas: (i) incubação de uma biblioteca randômica sintética de DNA ou RNA (contendo aproximadamente de 1014 a 1016 diferentes sequências) com o alvo molecular; (ii) separação das espécies ligadas das não ligadas; (iii) eluição das sequências ligadas ao alvo; (iv) amplificação das sequências ligantes por PCR (FIGURA 9). Esse processo pode ser repetido várias vezes com o intuito de aumentar a afinidade e especificidade das sequências encontradas. Os ácidos nucleicos selecionados por SELEX são chamados de aptâmeros e eles representam uma nova classe de agentes promissores nos campos de abordagens terapêuticas e de diagnóstico molecular (TUERK; GOLD, 1990).

54

FIGURA 9. Representação esquemática do processo de SELEX. Incialmente, uma biblioteca randômica sintética de DNA ou RNA (contendo aproximadamente de 1014 a 1016 diferentes sequências) é incubada contra o alvo molecular, em seguida as espécies ligadas são separadas das não ligadas para que na próxima etapa seja eluição apenas as sequencias de maior afinidade, que serão amplificadas por PCR. As sequências amplificadas podem ser utilizadas em novos ciclos de SELEX para garantir mais afinidades e especificada contra o alvo molecular. Retirado de http://www.sdu.dk/en/om_sdu/institutter_centre/c_evolna/background.

Os aptâmeros são pequenas sequências de DNA ou RNA simples-fita, variando de 20 a 100 bases, que são flanqueadas por duas constantes sequências contendo os sítios de ligação dos primers, que serão utilizados no processo de amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR). Esses oligonucleotídeos são altamente estruturados e podem especificamente reconhecer e interagir com diferentes moléculas, incluindo aminoácidos (FAMULOK, 1994; LUPOLD et al., 2002), proteínas (TABARZAD; JAFARI, 2016), anticorpos (LOGING; HARLAND; WILLIAMS-JONES, 2007) ou, até mesmo, células inteiras (CHEN et al., 2008; TANG et al., 2007). A afinidade de interação pode ocorrer na faixa de nanomolar a femtomolar sendo estabelecidas por diferentes forças 55

intermoleculares, como ligações de hidrogênio, forças de van der Waals, pareamento com as bases nitrogenadas, etc. Até hoje, já foram selecionados mais de 2000 aptâmeros contra aproximadamente 140 alvos diferentes (MAIER; LEVY, 2016). Os aptâmeros apresentam propriedades comparadas aos anticorpos, mas com algumas vantagens sobre eles. Eles apresentam menor tamanho, permitindo que alcance o alvo celular mais facilmente do que os anticorpos clássicos, podendo apresentar também maior afinidade contra seu alvo, são mais facilmente sintetizados e não são tóxicos, nem imunogênicos (KEEFE; PAI; ELLINGTON, 2010). Os aptâmeros também apresentam maior estabilidade térmica, que facilita seu estoque e transporte, e podem recuperar sua estrutura original mais facilmente após sofrerem desnaturação, diferentemente dos anticorpos (KEEFE; PAI; ELLINGTON, 2010). Entretanto, apresentam algumas limitações clínicas como a rápida digestão por nucleases presentes no sangue, e o rápido clearance renal, por serem moléculas bem pequenas. Essas limitações podem ser facilmente revertidas com a introdução de modificações químicas na sua molécula que aumente sua estabilidade frente a ação das nucleases e aumente o seu peso molecular, como, por exemplo, as modificações fosforotioatos e a peguilação, respectivamente (TABARZAD; JAFARI, 2016). Devido a sua capacidade de se ligar fortemente a proteínas e bloquear sua função, os aptâmeros também vêm sendo investigados na interrupção ou prevenção do acúmulo de proteínas mal formadas relacionadas a diferentes doenças conformacionais (QU et al., 2016). Os aptâmeros podem distinguir, até mesmo, diferentes conformações de uma mesma proteína (LEE et al., 2007), o que os torna agentes interessantes para terapia e diagnóstico de doenças como aquelas causadas pela PrP. Apesar de diversos estudos mostrarem a interação da PrP com uma grande variedade de sequências de ácidos nucleicos, muitas dúvidas ainda persistem a respeito do papel patofisiológico sobre a PrP. Com os objetivos de expandir os conhecimentos sobre a interação PrP-ácidos nucleicos, elucidar os mecanismos de conversão estrutural da PrP, e procurar por novas abordagens terapêuticas e de diagnóstico das doenças por prions, muitos estudos utilizaram da técnica de SELEX e identificaram ácidos nucleicos altamente específicos contra determinadas construções da PrP (TAKEMURA et al., 2006; WEISS et al., 1997). Como abordagem terapêutica, a ligação do aptâmero na PrP poderia prevenir sua conversão conformacional e propagação através da estabilização da proteína, 56

impedindo que a interação PrPC-PrPSc ocorra, ou através do bloqueio da interação da PrPC com algum cofator estimulante da sua patogênese (SEKIYA et al., 2006). Aptâmeros específicos para PrP também poderiam servir como ferramentas de diagnóstico, uma vez que poderiam detectar com grande sensibilidade a presença de conformações típicas da forma scrapie em tecidos e fluidos corporais (RHIE et al., 2003). Os primeiros aptâmeros descobertos contra a PrP foram selecionados por Weiss et al., em 1997, através da metodologia de SELEX utilizando como alvo molecular a forma inteira recombinante da PrP de hamster sírio (rPrP23-231). Esse aptâmero de RNA também se ligava com alta afinidade ao peptídeo da PrP compreendendo os resíduos 2352 na região N-terminal desestruturada da PrP, mas não era capaz de reconhecer a construção C-terminal da PrP (rPrP90-231), que não apresenta os resíduos da região Nterminal (WEISS et al., 1997). Esses aptâmeros foram capazes de interagir especificamente com a PrPC de homogenatos de cérebro de camundongos, hamsters e gados saudáveis, mas não são capazes de reconhecer a forma PrPres in homogenatos de cérebros de camundongos infectados com PrPSc, ou em extratos de cérebros de camundongos nocautes para PrP (WEISS et al., 1997). A interação da PrPC com esses aptâmeros de RNA se manteve conservada mesmo entre as diferentes espécies, o que despertou o interesse em estudar e identificar novos aptâmeros contra a PrP que podem se apresentar como moleculas promissoras em ensaios de diagnostico para as EETs. O mesmo grupo em 2001 também foi o primeiro a propor o papel terapêutico de aptâmeros contra a PrP, através da seleção do aptâmero DP7 com a modificação 2’-amino-2’deoxipirimidina, que garante sua estabilidade contra a digestão por endonucleases, e foi capaz de reduzir o acúmulo de PrPSc em células de neuroblastoma permanentemente infectadas com PrPSc (PROSKE et al., 2002). DP7 foi altamente especifico para o peptídeo da PrP humana contendo os aminoácidos 90-129, especula-se que bloquear essa região possa ser uma estratégia interessante para controlar a conversão já que ela está envolvida na conversão em folhas-β (PROSKE et al., 2002). A capacidade de interação de DP7 com a PrP era mantida mesmo utilizando-se PrP de diferentes espécies e na sua forma inteira (PrP23-231) (PROSKE et al., 2002). Em 2003, Rhie e et al., foram os primeiros a identificar aptâmeros de RNA que se ligavam preferencialmente a conformações relacionadas com a forma infecciosa da PrP (RHIE et al., 2003). O aptâmero chamado de SAF-93 foi selecionado contra fibras amiloides da forma scrapie e apresentou uma afinidade 10 vezes maior pela PrPSc do que pela PrPC e foram capazes de 57

inibir a propagação da PrPSc em ensaios típicos de conversão como o PMCA, tornando esse aptâmero interessante tanto para o diagnóstico como terapia das EETs (RHIE et al., 2003). Seguindo o potencial desses estudos, diversos autores usaram a técnica de SELEX e identificaram novas sequências ligantes de oligonucleotídeos contra a PrP inteira de diferentes espécies e contra domínios isolados da proteína, ou contra conformações associadas a forma scrapie (CAVALIERE et al., 2013; KINOSHITA, 2014; MASHIMA et al., 2009; MERCEY et al., 2006; MIODEK et al., 2013; SEKIYA et al., 2006; TAKEMURA et al., 2006; WANG et al., 2011). Foi revelado que a interação com a PrP era possível mesmo após a imobilização e modificação desses aptâmeros (KOUASSI e et al., 2007). Nessa tese utilizamos a técnica de SELEX com algumas modificações para identificar e estudar novas sequências de ácidos nucleicos específicos contra o domínio C-terminal estendido da proteína (PrP90-231). Esse domínio está diretamente envolvido na conversão em folhas-β e é capaz de reter a propriedade infecciosa em modelos de camundongos transgênicos (GROVAMN e et al, 2014). Acreditamos que a utilização de formas truncadas da PrP sem a região N-terminal, permita a identificação de ácidos nucleicos mais específicos para a PrP, já que diversos estudos vêm apontando para a ligação não especifica de NAs na região N-terminal. Com a seleção de novos aptâmeros, pretendemos validar sua interação com a PrP a partir de diferentes técnicas, como espectroscopia e calorimetria.

58

4.

CAPÍTULO 1 - OBJETIVOS

4.1. Objetivos gerais O primeiro capítulo desta tese tem como principais objetivos avaliar o papel dos ácidos nucleicos na patogênese da PrP e expandir os conhecimentos sobre a interação PrP-ácidos nucleicos através de estudos in vitro e in vivo. 4.2. Objetivos específicos:  Avaliar o efeito de ácidos nucleicos na estrutura, agregação e estabilidade da PrP, utilizando como modelo de estudo a PrP inteira recombinante de camundongo (PrP23-231), seu domínio C-terminal isolado (rPrP90-231) e o mutante com a deleção do domínio octarepeat (rPrP∆51-90)  Estudar diferentes oligonucleotídeos, variando em tamanho, sequência e estrutura tridimensional a fim de encontrar um padrão na molécula de ácido nucleico que dirija os diferentes efeitos observados após a interação com a PrP.  Calcular os parâmetros termodinâmicos de interação da rPrP com ácidos nucleicos como as constantes de associação, estequiometria de ligação e os valore de entropia, entalpia e energia livre do sistema.  Avaliar o efeito de oligonucleotídeos de DNA na propagação de prions, trabalhando com culturas de células permanentemente infectadas com duas diferentes cepas infecciosas da PrP (22L e RML)  Avaliar o efeito de oligonucleotídeos de DNA em modelos de conversão da PrPC em PrPSc in vitro, em ensaios livre de células.  Avaliar o efeito in vivo da inoculação intracerebroventricular de agregados da rPrP formados após a interação da PrP com DNA em camundongos saudáveis.  Selecionar novos aptâmeros de DNA contra a rPrP90-231 através da técnica de SELEX  Validar e caracterizar a interação dos novos aptâmeros descobertos contra a rPrP

59

5.

CAPÍTULO 1 - MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Reagentes A não ser quando especificado, todos os reagentes utilizados foram de grau analítico e adquiridos das empresas SIGMA-ALDRICH. A água utilizada foi obtida por ultrafiltração (a partir de água destilada) em sistema Milli-Q.

5.2. Olignucleotídeos

Os oligonucleotídeos não modificados e os modificados com a ligação fosforotioato foram obtidos das empresas Síntese Biotecnologia (Belo Horizonte, MG, Brasil) onde foram sintetizados em fita-simples, dessalinizados e purificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (TABELA 3). Os oligonucleotídeos escolhidos foram baseados em nossos estudos anteriores e apresentam diversidade de tamanho, sequência e estrutura (CHAVES et al., 2014; MACEDO et al., 2012). Para trabalhar com estruturas de DNA em dupla-fita (dsDNA), realizamos o anelamento das fitas complementares de DNA em tampão Tris 5 mM pH 7,5 contendo NaCl 250 mM, misturando ambas as fitas em concentração equimolar, aquecendo a mistura a 96 °C por 20 minutos e em seguida deixando a solução resfriar lentamente (overnight) até 25 °C. Para a sequência de RNA (R67) solubilizamos a fita simples em água estéril tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). A introdução da modificação fosforotioato, através da substituição do oxigênio no esqueleto de fosfato da molécula de DNA por um átomo de enxofre, em alguns oligonucleotídeos é uma estratégia para aumentar a resistência a digestão por nucleases sem alterar a carga ou estrutura da molécula (KOCISKO et al., 2006).

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TABELA 3. Sequência dos ácidos nucleicos avaliados Nome da Sequência D44 fita-senso D44-2x fita senso D67 fita-senso

Sequência (5'-3')

Conteúdo de GC Modificação

GTA ACC GAA ATC GGT TGA

44%

GTA ACC GAA ATC GGT TGA

44%

GTA ACC GAA ATC GGT TGA AAA GGA CGC GCG CGC GCG TTA

67%

AAA GGA CGC GCG CGC GCG TTA

67%

Não modificado Não modificado Não modificado

D67 2x fita senso

AAA GGA CGC GCG CGC GCG TTA

Não modificado

D44G fita-senso

GTG GCC GGG GTC GGT TGG

77%

Não modificado

D44s fita-senso

AGTGTTAGGTAGCACAAC

44%

Não modificado

D67A fita-senso

AAA AAA CAC ACA CAC ACA TTA

29%

Não modificado

D67s fita-senso

GCGTCGGCGGATACGAACCAG

67%

Não modificado

R67

AAA GGA CGC GCG CGC GCG UUA

67%

Não modificado

D44*

GTA ACC GAA ATC GGT TGA

44%

Fosforotioato

D67*

AAA GGA CGC GCG CGC GCG TTA

67%

Fosforotioato

*Indicada a presença da modificação fosforotioato no esqueleto da cadeia de nucleotídeos.

5.3. Expressão e purificação da proteína prion recombinante A proteína prion recombinante inteira de camundongo (rPrP) (compreendendo os resíduos 23-231) e seus domínios C-terminal (121-231), C-terminal estendido (90-231) e o mutante com a deleção da região octarepeat (∆51-90) foram expressos heterologamente em E. coli e posteriormente purificados por cromatografia de afinidade e por troca iônica. Os plasmídeos (pET21b) que contêm os genes que codificam as diferentes construções da rPrP, codificam também uma cauda de histidina fusionada na região N-terminal da PrP, um sítio engenheirado para facilitar a purificação e que pode ser facilmente retirado após clivagem com trombina. As células de Escherichia coli (E. coli) da linhagem BL21(DE3) foram transformadas com esses plasmídeos através de eletroporação ou choque térmico. A indução da expressão da rPrP foi efetuada adicionando-se isopropil tiogalactopiranosídio (IPTG) a 0,5 mM no meio de cultura Luria Bertani (LB) quando a 61

absorbância a 600 nm alcançou uma densidade óptica de 0,6. Após 8 horas sob agitação a 37o C, as células foram precipitadas por centrifugação (15 min a 6.000 rpm) e rompidas para extração da proteína de interesse. Homogeneizou-se a massa insolúvel de bactérias em tampão contendo ureia 6 M e submetido a uma hora de sonicação (Sonics Vibra-Cells, Newtown, CT, USA) no modo pulsado (1 segundo ligado, com intervalo de dois segundos de descanso) para o rompimento celular e dos corpos de inclusão. Após a sonicação, centrifugou-se o homogeneizado a 12.000 rpm por 30 minutos a 4 °C (Centrífuga Hitachi, rotor R12A6). Em seguida, adicionou-se a fração proteica solúvel a uma coluna contendo 6 mL de resina de agarose carregada com níquel (NTA-sepharose, GE healthcare, EUA), imobilizando a rPrP fusionada à cauda de histidina. Após 1 hora de incubação, foi realizada a remoção lenta (através de gradiente) da ureia da coluna, permitindo o reenovelamento oxidativo da proteína ligada à resina. Então, eluiu-se a proteína com tampão contendo imidazol 500 mM e posteriormente dialisada a 4 °C contra água milliQ overnight, para remoção do imidazol. Posteriormente, a cauda de histidina foi clivada com α-trombina humana. Testes de clivagem foram realizados para a estimar razão molar (trombina:PrP) e tempo de incubação adequados. A protease foi separada da proteína aplicando-se a solução em 10 mL da resina de troca iônica carbóxi-metil celulose (SigmaAldrich, Saint Louis, MO, EUA), equilibrada previamente com tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A proteína de interesse foi então eluída com gradiente de 0 a 500 mM de NaCl e as frações obtidas foram dialisadas contra água MilliQ overnight, para remoção da cauda de histidina. A pureza da proteína obtida foi determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e sua concentração aferida através de seu coeficiente de extinção molar (ε) a 280 nm, calculado através do programa ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html), a partir da sequência primária da proteína estudada. Após a obtenção da proteína devidamente pura e clivada, foi liofilizada e a seguir aliquotada e estocada em água estéril, congelada a -20 °C até o momento do uso, quando foi diluída nos tampões utilizados nos experimentos para obter-se a concentração final desejada. O controle de qualidade da PrP purificada foi realizado através da análise de estrutura secundaria e terciaria da proteína, e da integridade e solubilidade da proteína.

62

5.4. Peptídeos da PrP Os peptídeos da PrP utilizados neste trabalho, PrP109-149 (peptídeo da PrP de hamster sírio compreendendo os resíduos 109-149 e PrP106-126 (peptídeo da PrP humana compreendendo os resíduos 106-126) foram obtidos por síntese química em fase sólida e purificado por cromatografia líquida de alta performance de fase reversa (RP-HPLC) pela empresa Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX, USA), com alto grau de pureza. Na tabela abaixo (TABELA 4) encontra-se o alinhamento da sequência de aminoácidos desta região da PrP em hamsters e humanos.

TABELA 4. Alinhamento das sequências de aminoácidos do peptídeo PrP109-149 de hamsters sírios e de humanos Espécie

Sequência primária da região de aminoácidos 109-149

Hamster

MKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSMASRPMMHFGNDWEDR

Humano

MKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSMASRPIIHFGSDYEDR

Os resíduos de aminoácidos em negrito e sublinhado ressaltam as pequenas diferenças entre as sequencias primárias dos dois peptídeos.

5.5. Medidas de espalhamento de luz

A agregação da rPrP na presença dos oligonucleotídeos selecionados foi monitorada por espalhamento de luz estático (LS) em um fluorímetro Jasco FP6300 (Tóquio, Japão). O LS das amostras foi monitorado a 90o em relação à incidência da luz de excitação, e os valores de LS estão diretamente relacionados ao tamanho médio das partículas em solução (SZABO, 2000). Sendo assim, uma vez ocorrendo o processo de agregação, observar-se-ia um aumento significativo nos valores de LS. As amostras foram iluminadas a 320 nm e coletou-se o valor de LS de 300 a 340 nm. O comprimento de onda foi apropriadamente escolhido para que nenhuma das moléculas presentes em solução absorvesse a luz incidida. A mesma amostra foi lida três vezes e três experimentos independente foram realizados.

63

Além disso, realizamos medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) em um equipamento DynaPro NanoStar (Wyatt, CA, EUA). O DLS nos permite calcular o perfil de distribuição de tamanho de partículas em solução, a partir da estimativa do raio hidrodinâmico e da polidispersividade de tamanho das moléculas da amostra. Este tipo de medida é realizado ao incidir um laser sobre uma suspensão contendo as partículas alvo. Estas partículas tendem a espalhar a luz do laser (662 nm) por todas as direções e o vetor de espalhamento pode ser detectado por uma fotomultiplicadora (GOLDBURG, 1999). A técnica apresenta um limite máximo de detecção de 1 µm. Nas análises de DLS, o raio hidrodinâmico (Rh) da PrP e dos complexos formados a partir da interação PrP:Oligonucleotídeos foram calculados considerando-se as flutuações de intensidade e as distribuições de frequência originadas da difusão translacional dessas partículas em solução. A presença de impurezas como contaminantes, poeira, prejudica as medidas de LS, por isso as amostras em solução foram cuidadosamente filtradas e/ou centrifugadas antes da realização das medidas. Nos experimentos realizamos 3 medidas da mesma amostra, cada medida apresenta 10 aquisições de 5 segundos. A PrP a 20 µM foi incubada com 20 µM de DNA ou RNA.

5.6. Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

A Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) utiliza as propriedades de espalhamento de luz e movimento browniano para obter a distribuição de tamanho das partículas nas amostras em solução. Um feixe de laser é passado através da câmara de amostragem, as partículas em suspensão no caminho do feixe espalham a luz de modo que elas podem ser visualizadas com um microscópio com aumento de 20 vezes sobre o qual é acoplado uma câmera de vídeo. A câmera captura um arquivo de vídeo das partículas em movimento browniano. O software rastreia muitas partículas individualmente e usando a equação de Stokes-Einstein calcula seu diâmetro hidrodinâmico (FILIPE; HAWE; JISKOOT, 2010). A técnica apresenta um limite máximo de detecção de 1 µm. Esse instrumento proporciona alta resolução das medidas de tamanho, concentração e agregação das partículas e foi usado para caracterizar os diferentes agregados da PrP. Para as medidas experimentais foi utilizado 5 µM de rPrP

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com concentrações equimolares de ácidos nucleicos, o tampão de incubação foi Tris 20 mM com 100 mM de NaCl, pH 7,4 a 25º C.

5.7. Espectroscopia de fluorescência

A espectroscopia de fluorescência pode monitorar a fluorescência intrínseca das proteínas, resultante da emissão de fluorescência dos aminoácidos aromáticos presentes em sua estrutura, e também a fluorescência extrínseca, emitida por sondas fluorescentes, como por exemplo a tioflavina T. Os resíduos aromáticos (tirosina, triptofano e fenilalanina) presentes na maioria das proteínas, quando excitados por uma fonte luminosa em um determinado comprimento de onda, absorvem a luz e a emitem em um comprimento de onda maior. Como são estruturalmente diferentes, cada um dos três aminoácidos aromáticos apresenta diferentes rendimentos quânticos, ou seja, emitem luz com intensidades diferentes mesmo quando são excitados pela mesma fonte luminosa. A emissão do triptofano é a que mais contribui para o espectro de emissão de fluorescência da proteína (LAKOWICZ, 2006). Geralmente, quando se encontram em meio aquoso, as proteínas se enovelam de forma que seus aminoácidos hidrofóbicos fiquem agrupados em seu interior, enquanto os resíduos polares são expostos ao meio aquoso. Esse arranjo estrutural apresenta uma baixa energia livre, conferindo uma maior estabilidade às proteínas (DOBSON, 2004). Como o triptofano é um aminoácido prevalentemente hidrofóbico, este se mantém preferencialmente no interior das moléculas proteicas. Quando as proteínas são submetidas à ação de agentes desnaturantes (físicos ou químicos), sua estrutura é rearranjada e os resíduos de triptofano passam a ficar expostos ao meio aquoso, levando a uma diminuição do seu rendimento quântico pela exposição de seu núcleo indol a um ambiente desfavorável (polar), que promove um desvio do seu espectro de fluorescência para comprimento de ondas maiores. Uma vez que o desenovelamento das proteínas aumenta a exposição de seus resíduos ao solvente, o acompanhamento das mudanças na emissão de fluorescência de determinados fluoróforos, como o triptofano, possibilita o

65

acompanhamento do caminho percorrido entre os níveis mais organizados (proteína nativa) e o completo desenovelamento de uma proteína (LAKOWICZ, 2006).

5.7.1.

Fluorescência Intrínseca

As medidas de fluorescência intrínseca foram realizadas no espectrofluorímetro JASCO FP6300 (Jasco, Tóquio, Japão). As amostras foram excitadas a 280 nm e a emissão de fluorescência coletada de 300 a 420 nm em três medidas consecutivas. Os resultados apresentados correspondem a média de três experimentos independentes. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

5.7.2. Supressão de fluorescência

A supressão da fluorescência pode ocorrer por mecanismos dinâmico (colisional) ou estático. A supressão colisional ocorre quando o fluoróforo, no estado excitado, é desativado após interagir com o supressor em solução, sem que ocorra alteração química. Já a supressão estática ocorre quando o fluoróforo, no estado excitado, retorna ao estado fundamental através da formação de uma ligação eletrônica com seu supressor. A desativação do estado excitado destes processos pode ocorrer através de vários mecanismos como, por exemplo, reações do estado excitado, transferência de energia, transferência de elétrons ou formação de complexos. O processo colisional de supressão de fluorescência pode ser descrito pela equação de Stern-Volmer (Equação 1) (LAKOWICZ, 2006). Onde F0 e F sãos as intensidade de fluorescência na ausência e presença do agente supressor, respectivamente; Kq é a constante de supressão bimolecular, τ0 é o tempo de vida do fluoróforo na ausência supressor, [Q] é a concentração do supressor, e KSV é a constante de Stern-Volmer. Quando construímos um gráfico de F0/F versus [Q] é esperado uma reta, onde o coeficiente angular é igual a KSV. Quanto maior a constante de Stern-Volmer, maior a acessibilidade do fluoróforo ao 66

agente supressor. Utilizamos a acrilamida nos ensaios de Stern-Volmer como agente de supressão.

(Equação 1)

5.8. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)

As medidas de dicroísmo circular (CD) nos permitem analisar o conteúdo de estrutura secundária e terciária de proteínas (JOHNSON, 1988). A espectroscopia de CD mede a diferença na absorção de luz circularmente polarizada para esquerda e para direita de uma molécula quiral. Para avaliar a estrutura secundária são feitas medidas na região de ultravioleta distante (de 260 a 180 nm). Valores negativos máximos de elipcicidade em 222 e 208 nm indicam a presença de uma estrutura predominantemente em α-hélice e valores de elipcicidade negativos entre 215 e 225 nm sugerem a presença de estrutura em folha-β (JOHNSON, 1988) (FIGURA 10). As medidas de CD foram realizadas em um espectropolarímetro Chirascan (Applied Photophysics, Surrey, UK), utilizando cubetas de quartzo de 1,00 ou 2,00 mm de caminho óptico. Os espectros foram resultantes da acumulação de, no mínimo, três medidas consecutivas. Os espectros coletados abrangem comprimentos de onda maiores que 260 nm (de 320 a 190 nm) para que pudéssemos avaliar também a estrutura dos ácidos nucleicos. O método de CD também pode ser utilizado para analisar estrutura secundaria e terciárias de ácidos nucleicos em baixa ou alta concentração, utilizando desde pequenos oligonucleotídeos até sequências longas. A técnica permite ainda medir a cinética de formação de confôrmeros particulares do DNA ou RNA e calcular seus parâmetros termodinâmicos. Por isso, a espectroscopia de CD é uma ferramenta útil para mapear as propriedades conformacionais de moléculas partículas de DNA ou RNA (KYPR et al., 2009). As aquisições foram obtidas na velocidade de 3 segundos de tempo por nanômetro, subtraído da linha de base obtida empregando-se os mesmos parâmetros de aquisição. Os resultados são expressos como valores de elipcicidade bruta (em miligraus) ou elipcicidade molar (mgrau.cm2.dmol-1).

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FIGURA 10. Espectro de CD para estrutura secundária de proteínas. Espectros de CD típicos de estruturas protéicas em α-hélice (laranja), folhas-β (azul) e estrutura desordenada (randômica) (vermelho) (WHITMORE; WALLACE, 2008)

5.9. Calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

O microcalorímetro de titulação isotérmica (MicroCal iTC200, GE Healthcare Life Sciences) mede diretamente o calor liberado ou absorvido em amostras líquidas como resultado da injeção de determinadas quantidades de reagentes. O ITC200 apresenta um par de câmaras idênticas (amostra e referência), feitas de uma liga metálica inerte, denominada Hastelloy, que estão localizadas no interior de um compartimento adiabático composto por duas camadas: interna e externa. As câmaras devem estar totalmente preenchidas com líquido durante os experimentos, o que requer aproximadamente 0,2 mL de solução por câmara. Deve-se ressaltar que a câmara de referência é preenchida com água e não participa da titulação. Uma seringa, acoplada a uma agulha de aproximadamente 10 cm de comprimento cuja terminação assemelha-se a uma pequena pá, é utilizada para injetar e promover a mistura do conteúdo na câmara (FIGURA 11).

68

FIGURA 11. Modelo esquemático do ITC. Retirado de http://ch301.cm.utexas.edu.

A técnica de ITC permite monitorar a mudança de calor que ocorre quando um ligante interage com a proteína alvo. Através dessa técnica avaliamos a interação de diferentes construções da PrP com os oligonucleotídeos selecionados e com os novos aptâmeros identificados nesta tese. Foi possível determinar os parâmetros físico-químicos desta interação, particularmente com o cálculo dos parâmetros termodinâmicos para os processos associativos, como a constante de associação (Ka = 1/Kd), a mudança padrão de entalpia e entropia e a estequiometria de ligação. A concentração da proteína na célula de amostra utilizada em todos os experimentos foi 5 µM e realizamos, em geral, 20 injeções de 1 ou 2 µL de DNA ou RNA na concentração de 100 ou 50 µM conforme especificado em cada caso. O volume da primeira injeção é sempre de um valor muito menor e será excluído na análise dos parâmetros termodinâmicos, esse procedimento é realizado para minimizar o impacto de artefatos de equilíbrio muitas vezes observados durante a primeira injeção. O poder da referência foi escolhido para 8 µcal/s, já que não tínhamos uma ideia inicial de que tipo de reação iria ocorrer (exotérmica ou endotérmica) quando os dois ligantes se encontrarem, e por isso, escolhemos um valor intermediário. O espaçamento entre cada injeção foi de 150 segundos, o tempo necessário para o calor da reação retornar ao 69

equilíbrio (próximo à linha de base). A rotação foi mantida constante em 700 rpm ao longo de todo o experimento. Em todas as curvas o calor de diluição do oligonucleotídeo em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 foi devidamente subtraído de forma que o calor observado no experimento corresponde apenas ao calor resultante da interação entre as duas moléculas. Esse tampão foi previamente escolhido por ser bastante inerte e não interferir no calor de diluição ao longo dos experimentos no ITC.

5.10.

Microscopia eletrônica de transmissão

O microscópio eletrônico é composto por um tubo com vácuo, onde está localizado um cátodo em formato de agulha, que produz um raio de elétrons. Uma alta voltagem (entre 50 e 150 kV) é aplicada no tubo, fazendo com que o feixe de elétrons seja acelerado no vácuo, passando através de uma pequena abertura no anodo, localizado no interior do tubo. A seguir, esse raio é focado por um condensador e passa através da amostra, sendo parcialmente defletido.

O grau de deflexão depende da densidade

eletrônica da amostra, que é proporcional à massa dos átomos que a constituem. Normalmente, as amostras biológicas são compostas por átomos com números atômicos baixos, que geram pouco contraste. Dessa forma, é preciso tratar previamente essas amostras com substâncias especiais (geralmente metais pesados, como o urânio) para a obtenção de algum contraste (LODISH e et al, 2000). Após passar pela amostra, os elétrons espalhados são captados por uma objetiva, formando uma imagem, que em seguida é ampliada por um sistema adicional de lentes.

Essa imagem formada é

transmitida para uma tela, onde pode ser observada e fotografada, mas sempre em preto e branco, onde os pontos mais escuros são as regiões com maior densidade eletrônica nas amostras (ALBERTS, 2002). Os ensaios de microscopia foram realizados em um microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1200 (Boston, MA, USA) presentes na plataforma CENABIO da UFRJ operando sob uma voltagem de 80 kV. Em geral, 20 μL de amostra foram aplicados em uma pequena grade de cobre coberta por Formvar®, com uma malha de 100 μm. Após intervalo de 10 minutos, a grade foi rapidamente lavada três vezes com água Milli-Q e em seguida as amostras foram contrastadas negativamente com acetato de uranila 2%

70

(diluído em água) por 60 segundos, sendo o excesso removido com papel de filtro, tornando-as pronta para visualização.

5.11.

Ensaios em cultura de células

Para os ensaios em cultura de células foi utilizada uma linhagem de células de neuroblastoma

de

camundongo

(N2a)

e

uma

linhagem

de

neuroblastoma

permanentemente infectada com a forma infecciosa scrapie da PrP (ScN2a) (cepa 22L ou RML) mantidas em cultura em meio DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB) e 1 % de solução antibiótica (gentamicina), numa atmosfera de 5% de dióxido de carbono (CO2). A cada dois ou três dias, após as células em cultura atingirem o estágio de subconfluência (ocupando 80 % da área cultivável do frasco), foi feito o repique ou plaqueamento das células em placas de 96 poços (~ 50000 células) para os ensaios de viabilidade em células N2a e para os ensaios de tratamento de células ScN2a.

5.11.1. Redução do MTT

Sais de tetrazólio pertencem a um grande grupo de compostos orgânicos heterocíclicos que apresentam alta coloração e formam cristais de formazan insolúveis após redução. A redução do sal de tetrazolio MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-y1]-2,5-brometo feniltetrazolio) é um dos métodos mais utilizados para medir a proliferação celular e citotoxicidade. O MTT é reduzido pela atividade mitocondrial em células vivas. O MTT reduzido pelas células é confinado em vesículas intracelulares na forma de cristais de formazan (LIU e et al., 1997). Esses cristais ao serem solubilizados com DMSO conferem uma coloração roxa à solução (LIU e et al., 1997). Dessa forma, é possível estabelecer uma relação entre a intensidade da coloração à quantidade de células vivas. Em geral, após 72 horas de tratamento com nossas amostras uma solução de MTT com concentração final de 1 mg/mL é adicionado em cada poço e a placa foi incubada por 3 horas a 37 °C numa atmosfera de 5 % de CO2, para permitir que as células metabolizassem o MTT. A seguir todo o meio foi removido e adicionou-se 200 µL de DMSO para permitir a 71

solubilização do formazan produzido. A leitura da absorvância do MTT reduzido foi realizada a 540 nm em um SpectraMax M5 Microplate Reader.

5.11.2. Tratamento de células permanentemente infectadas com scrapie

Os ensaios com células infectadas com diferentes cepas de prions, 22-L e RML, provenientes de cérebros de camundongos doentes, foram realizados no Laboratory of Persistent Viral Diseases, dos Rocky Mountain Laboratories (RML), NIH/NIAID em Montana nos EUA, com a colaboração da Dra. Natália do Carmo Ferreira. Esses experimentos foram realizados com nível 2 de segurança que permite trabalhar com agentes infecciosos. Para testar o efeito de oligonucleotídeos de DNA no processo de propagação de prions em células ScN2a, tratamos essas células com diferentes concentrações de oligonucleotídeos, e através de um ensaio de resistência a digestão por PK calculamos a quantidade da forma resistente da PrP (PrPRES) presente naquela cultura. O experimento foi realizado em placa de 96 poços e os oligonucleotídeos foram adicionados 4 horas após o repique das células na placa, os oligonucleotídeos em diferentes concentrações foram adicionados e incubados com as células ao longo de 3 dias. Em seguida, as células foram lisadas e tratadas com PK e o material resultante da digestão foi transferido para uma membrana de nitrocelulose através de um sistema de vácuo. Como a PrPC é sensível à digestão por PK, após o tratamento com esta enzima, só é possível detectar a forma infecciosa da PrP que é resistente à digestão. A detecção foi realizada por técnicas como western-blot e dot-blot com anticorpo anti-PrP R20 que reconhece o fragmento que compreende os resíduos 93-109, que resiste à digestão por PK.

5.12. Dot-blot

A técnica de dot-blot foi utilizada para avaliar o efeito de ácidos nucleicos na propagação de prion em células ScN2a infectadas com diferentes cepas (22-L ou RML). Após o tratamento das células com os oligonucleotídeos em diferentes concentrações o meio de cultura foi removido e 50 μL de tampão de lise (5 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% 72

Triton X-100 E 0,5% de deoxicolato de sódio) foram adicionados a cada poço. Após a adição de 25 μL de benzonase (solução estoque 324 U/ μL) (Sigma-Aldrich), a placa foi mantida a 37 ºC por 30 minutos e, em seguida, foram adicionados 25 μL de proteinase K (solução estoque 0.1 mg/mL) (Calbiochem). A placa foi novamente mantida a 37 ºC, dessa vez, durante uma hora. Após a digestão, foram adicionados 200 μL de Pefabloc (solução estoque 1 mM) (Boehringer Manheim) para interromper a ação da PK. Uma membrana de PVDF (fluoreto de polivinidileno) (Immobilon-P, Millipore) previamente ativada com 100% de metanol, em seguida rinsada com água e equilibrada com TBS (Tris buffered saline) por 15 minutos foi colocada no aparato de dot blot (Minifold-1, Schleicher & Schuell BioScience GmbH). Em seguida, a amostra tratada de cada poço da placa de cultivo celular foi transferida para um poço particular no aparato de dot blot e com o auxílio de um sistema a vácuo a amostra é transferida para a membrana de PVDF. Após a transferência, a membrana foi removida do aparato de dot blot e incubada em 3 M de isotiocianato de guanidina por 8 minutos, para provocar a exposição dos epítopos. Após 4 lavagens com TBS, a membrana foi incubada com o anticorpo primário (R30 1:5000 ou 6D11 1:7500) durante 1 hora em TBS-T (TBS com 0.05% de tween) com 5% de leite desnatado. Após lavar a membrana com TBS-T, o anticorpo secundário foi adicionado (1:5000) e incubado por pelo menos uma hora. A membrana foi então lavada com TBS-T e o reagente AttoPhos (Promega) foi adicionado. Após a membrana ficar seca, realizou-se a leitura no scanner Typhoon (GE Healthcare). A intensidade de cada dot foi quantificada através do programa ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij). Os resultados foram apresentados na forma de barras que refletem a quantificação da banda de dot-blot. Esses ensaios também foram realizados nos RML pela Dra. Natália do Carmo Ferreira.

5.13.

Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC)

O RT-QuIC é uma metodologia que permite a conversão in vitro de PrPC em PrPSc, em um ensaio livre de células, através da incubação de diminutas quantidades de homogenato de cérebro de animais infectados com PrPSc, utilizado como semente para a reação de conversão PrPC em PrPSc, enquanto a PrP recombinante purificada é utilizada como substrato da reação (WILHAM et al., 2010). A reação ocorre em um leitor de fluorescência com agitador de duplo orbital FluoStar Plate Reader OPTIMA (BMG 73

Labtech Polarstar, Cary NC, EUA) com agitação vigorosa e constante que contribui por fragmentar os agregados de PrP, liberando as sementes para conversão. As reações de RT-QuIC foram realizadas adicionando-se 2 µL de homogenato de cérebro (diluição 107

em tampão 0.1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) em PBS, pH 7.4) a 98 μL do tampão

de RT-QuIC (50 mM NaPO4, 10 μM tioflavina T (Sigma), 1 mM ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), 300 mM NaCl) contendo o substrato, a rPrP, na concentração final de 0.1 mg/ml por poço. As reações ocorreram em quadruplicata em placa de 96 poços preta com o fundo transparente (Nalgene Nunc International, Penfield, NY, EUA). A reação é realizada a 42º C durante 120 horas com ciclos de 1 min de agitação (700 rpm) seguidos por 1 min de repouso e, então, o produto da reação resistente à digestão por PK, PrPRES é quantificado. Essa metodologia nos permitiu avaliar se os oligonucleotídeos são capazes de interagir com a PrPC ou PrPSc e modular a reação de conversão, acelerando ou diminuindo o acúmulo das formas da PrP associadas à doença em um modelo mais próximo da realidade. Esses ensaios também foram realizados nos RML, que possui o nível de segurança exigido e foram feitos com a colaboração da Dra. Natália do Carmo Ferreira.

5.14.

Ensaios de inoculação in vivo

Estes ensaios foram realizados em colaboração com a Profa. Claudia P. Figueiredo da Faculdade de Farmácia, UFRJ e com a Dra. Mariana Pierre de Barros Gomes, UFRJ. Utilizamos camundongos C57Bl6 machos selvagens, com aproximadamente 3 meses de idade oriundos do Biotério da FIOTEC (Fiocruz). Os animais foram mantidos em câmaras ventiladas, com temperatura controlada de 22 ± 1°C, umidade entre 60 – 80%, ciclo claro/escuro de 12 h e alimentados com ração comercial e água ad libitum. O presente estudo seguiu as recomendações do Guia de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos da América (NIH Publication No. 85-23, revisado em 1996). Os experimentos foram realizados após a aprovação do protocolo pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRJ. O protocolo sob o número de referência FARMACIA07-04/16 aprovou o projeto intitulado: Aspectos Fisiológicos e Toxicológicos da Interação da Proteína Prion com Ácidos Nucleicos.

74

Antes da inoculação, os camundongos foram anestesiados com isofluorano (2,5 %; Abbot Laboratórios do Brasil Ltda., Brasil) através de um sistema de vaporização com fluxo controlado, específico para animais de pequeno porte (Harvard Apparatus, MA, USA). Os animais foram divididos em três grupos, com n = 15 por grupo. Os animais que foram submetidos a uma única injeção intracerebroventricular (icv) de 3 µL da proteína livre a 100 µM formaram o grupo PrP, aqueles que receberem 3 µL de complexo PrP:DNA agregado na razão molar 1:1, com 100 µM PrP e 100 µM de DNA D67 formaram o grupo Agg, e aqueles que receberam apenas o veículo de diluição formaram o grupo PBS (controle). A injeção foi free hand, conforme previamente descrito por (FIGUEIREDO et al, 2011). Os três grupos de animais foram submetidos a diferentes testes de comportamento, como campo aberto, pole teste, medo condicionado e o plusmaze (labirinto em cruz elevado). Os testes foram realizados pela manhã, em sala de 20 m2, com pessoas em silêncio no interior da sala para cronometrar os tempos, com a exceção do teste plus-maze onde o comportamento dos animais foi observado por gravação. Alguns animais eventualmente se machucaram por brigas entre eles e foram eutanasiados para não interferir nos testes, por isso o número de animal de cada grupo nos diferentes experimentos será apresentado na legenda da figura correspondente. Ao término das avaliações comportamentais todos os animais foram eutanasiados, os encéfalos foram removidos e congelados para futuras análises O teste campo aberto é realizado em uma arena quadrada com 120 cm cercada por paredes com 45 cm de altura, de forma que o animal não possa fugir. O assoalho é marcado com pequenos quadrantes (12 quadrantes) que permite a quantificação da atividade locomotora do animal (CHOLERIS et al., 2001). A quantidade de vezes que o animal cruza cada quadrante é contabilizado como ‘crossing’ e a quantidade de vezes que ficam de pé apoiados pelas patas traseiras é contabilizado como ‘rearing’. Os animais foram testados durante 5 minutos. O pole teste pole é um paradigma utilizado na avaliação da bradicinesia (OGAWA et al., 1985). O animal precisa ter habilidade nos membros dianteiros para conseguir agarrar a haste e se virar para baixo. O aparato consiste em uma haste metálica de 45 cm de altura e 1 cm de diâmetro envolvida em gaze. Os animais foram colocados no topo da haste com a face voltada para cima e foi medido o tempo gasto para se orientarem para baixo (tempo de virada) e o tempo gasta para descerem do topo da haste até a sua base (tempo de descida). 75

O paradigma do medo condicionado, é um teste comportamental no qual uma associação é feita entre um contexto situacional e um estímulo aversivo (nesse experimento, o choque elétrico). Camundongos normais treinados um dia antes apresentam uma resposta de medo e permanecem imóveis (freezing) no dia seguinte quando colocados no mesmo ambiente que recebeu o estímulo aversivo como resposta de memória associada ao medo (SHOJI et al., 2014). Nesse experimento calculamos o tempo de ‘freezing’ dos animais previamente treinados. O teste de plus-maze elevado é um método validado para explorar as bases neurobiológicas da ansiedade (ZANGROSSI; GRAEFF, 1997). Para isso utilizamos um aparato em formato cruz elevado a 50 cm do chão com quatros braços. Dois braços possuem paredes, sendo chamados de braços fechados, e outros dois não possuem as paredes, correspondendo aos braços abertos. Os animais são colocados individualmente na área central e observados durante cinco minutos. O comportamento observado é o tempo gasto nos braços abertos e nos braços fechados e o número de entradas feitas em ambos os braços, o que reflete um conflito entre a preferência dos camundongos por áreas protegidas (braços fechados) e a motivação inata deles em explorar novos ambientes (braços abertos). Nesse teste, a ansiedade é avaliada pela preferência do camundongo por ambientes escuros e pelo medo não-condicionado de altura/espaços abertos.

5.15. Seleção de aptâmeros de DNA – SELEX e Clonagem

A técnica de SELEX permite identificar oligonucleotídeos de alta afinidade e especificidade contra a determinado alvo molecular (ver seção 1.11). Nesse ensaio, a biblioteca de aptâmeros de DNA contendo milhares de sequência de oligonucleotídeos diferentes foi adquirida comercialmente (Universidade de Nottingham, UK). Todos os oligonucleotídeos

são

flanqueados

pelos

GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-3)

mesmos e

primers:

forward

reverso

(5'– (5’-

GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA-3’). Na reação de SELEX aproximadamente 5 mg/mL do domínio C-terminal estendido da PrP (rPrP90-231) com uma calda de histidina foi imobilizada na sua conformação nativa em coluna de cromatografia por afinidade com níquel (HiTrap 1 mL) e lavada com tampão Tris 5 mM, pH 7,4. A biblioteca inicial de aptâmeros foi diluída 5 vezes em volume final de 1 mL no mesmo tampão de lavagem e, 76

em seguinte, foi adicionada à coluna contendo a rPrP90-231 previamente imobilizada. A reação de incubação foi de uma hora a temperatura ambiente. As espécies não ligadas ou ligadas com baixa afinidade foram removidas após lavagem com tampão com baixa concentração de cloreto de sódio (NaCl) (Tris 5 mM, NaCl 150 mM pH 7.4). A eluição dos aptâmeros foi realizada em duas etapas, uma com 1 mL de tampão com alta concentração de NaCl (1,5 M) e outra com 1 mL de tampão tiocianato de sódio (NaSCN) a 3,0 M. As amostras eluídas separadamente foram dessalinizadas e concentradas mais de 20 vezes com filtros Vivaspin 500 (GE Healthcare) com cut off de peso molecular de 3 kDa, e então amplificadas por PCR utilizando os primers da biblioteca inicial desses aptâmeros (0,25 mM do primer foward e 25 mM do primer reverse). A adição de um dos primers em excesso garante que o primer estará ligado nas fitas separadas de DNA evitando que elas sofram anelamento, entre si, quando a temperatura abaixar. Como controle negativo para amplificação utilizamos água ao invés de DNA. A reação de amplificação por PCR ocorre durante 8 horas. As amostras amplificadas podem ser analisadas em gel de agarose 2 % para detecção dos aptâmeros de DNA. Um novo ciclo de SELEX contra a rPrP90-231 é realizado dessa vez com as amostras de aptâmeros que foram amplificados no ciclo anterior. Realizamos um total de 5 ciclos para garantir que os aptâmeros apresentassem alto grau de afinidade e especificidade para o nosso alvo. Esses ciclos foram realizados com o acompanhamento do professor Sotiris Missaelidis (Fiocruz). No último ciclo a eluição foi realizada com gradiente de concentração salina, variando de 1,0 M a 1,5 M de NaCl com incrementos de 100 mM, e amostras foram estocadas separadamente. Selecionamos os aptâmeros eluídos na maior concentração de NaCl para seguir com a clonagem e sequenciamento. As frações com maior afinidade, eluídas com maior concentração de sal, foram clonadas em bactérias quimicamente competentes (E. coli Top10) usando o vetor pcRH2.1TOPOH do TOPOH TA Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific). O kit é engenheirado para que somente as bactérias transformadas com o vetor contendo a nossa sequência de clonagem possam crescer e formar colônias. As colônias aptâmero-positivas foram, então, inoculadas e crescidas individualmente em 25 mL de meio LB a 37o C sob agitação a 200 rpm. Isolamos o DNA plasmidial utilizando kit de mini-prep (Thermo Fisher Scientific) de cada inóculo para posterior sequenciamento. Dentro de cada plasmídeo deve estar inserido o aptâmero clonado e posterior sequenciamento é guiado e

77

validado pela presença dos primers conhecidos da biblioteca inicial dos aptâmeros e pela sequência dos vetores de clonagem.

5.16. Sequenciamentos dos aptâmeros isolados Após 5 ciclos da técnica de SELEX, e posterior clonagem em vetor bacteriano foi possível isolar 22 plasmídeos contendo os aptâmeros que selecionamos contra a rPrP90231

. Esses plasmídeos foram encaminhados para uma plataforma de sequenciamento da

FIOCRUZ, gerando um total de 44 eletroferogramas, uma vez que as frações foram sequenciadas em ambos os sentidos (foward e reverso). Durante o sequenciamento utilizando os primers T3 e T7, presentes no vetor de clonagem. O sequenciamento foi dividido em duas etapas, primeiramente sequenciou-se 12 frações e, posteriormente, as 10 fraçoes restantes foram analisadas. A reação de sequenciamento foi realizada segundo o método de dideoxinucleotídeos (SANGER et al., 1977) com modificações. Na reação foi utilizado 0,5 µL do Kit BigDye® Terminator por reação. O volume final de reação foi de 10 µL e os primers foram utilizados na concentração de 3,2 pmol/µL. A reação de sequenciamento foi realizada por eletroforese capilar no sequenciador automático ABI 3130 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific). Os eletroferogramas foram analisados com o uso do programa gratuito BioEdit versão 7.2.5, disponível no site http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html. Dos 24 eletroferogramas obtidos no primeiro sequenciamento, somente 4 geraram resultados analisáveis e compatíveis com os primers da biblioteca. No segundo sequenciamento todas as 10 frações geraram eletroferogramas analisáveis. O mesmo processo de análise foi utilizado para essas frações. 5.17. Análise Estatística Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.). A avaliação estatística dos resultados foi realizada através da análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, adequadas ao protocolo experimental. Posteriormente, os grupos 78

foram comparados entre si empregando-se o teste Tukey. Valores de P menores ou iguais a 0,05 (P < 0,05) foram considerados como indicativos de significância. Todas as comparações estatísticas foram efetuadas utilizando-se o pacote GraphPad Prism.

79

6. CAPÍTULO 1 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1.

Efeito dos oligonucleotídeos na estrutura terciária e na agregação da

rPrP

Em nossos estudos anteriores, mostramos que duas diferentes sequências de DNA, D67 E D44 (ver seção Material e Métodos), ao interagir com a PrP recombinante (rPrP), induzem a agregação imediata da rPrPC com alteração de estrutura terciária e secundária da rPrP, entretando os níveis de alteração eram diferentes dependendo da sequência de DNA avaliada (MACEDO e et al., 2012). Vimos também que as estruturas da rPrP formadas na presença de DNA podem apresentar perfis citotóxicos distintos para uma mesma linhagem celular, dependendo da sequência de DNA empregada (MACEDO e et al., 2012). Com o propósito de identificar quais padrões na molécula de ácido nucleico, como sequência, estrutura ou tamanho, são responsáveis por guiar a interação com a rPrP e ditar esses diferentes resultados, expandimos nossas análises trabalhando também com outras sequências baseadas nos DNAs citados acima. Incluímos o oligonucleotídeo D44G, onde todas as bases nitrogenadas adenina do D44 foram substituídas por guanina; D44s, apresentando a mesma sequência do D44 só que em posições scrambled (embaralhadas); D67A, onde todas as bases nitrogenadas guanina do D67 foram substituídas por adenina; D67s, apresentando a mesma sequência do D67 só que em posições embaralhadas; D44-2x e D67-2x, apresentando uma dupla repetição da sequência do D44 e do D67, respectivamente e, portanto, com o dobro do tamanho de pares de bases. A partir das técnicas de emissão de fluorescência intrínseca e espalhamento de luz estático (LS), monitoramos as mudanças na estrutura terciária e o processo de oligomerização da proteína, respectivamente, após a interação com os oligonucleotídeos fita dupla de DNA, como D44G, D44s, D67A, D67s e a fita simples de RNA, R67 (mesma sequência do oligonucleotídeo D67) (FIGURA 12). Observamos um aumento nos valores de LS à medida que adicionávamos o oligonucleotídeo na amostra contendo rPrP23-231, o que nos sugere que a rPrP inteira sofre oligomerização imediatamente após a adição de DNA. A ligação de ambos os oligonucleotídeos de DNA à proteína suprimiu a emissão 80

de fluorescência dos seus aminoácidos aromáticos, indicando que o ambiente químico experimentado por esses resíduos foi modificado após a interação com o ácido nucleico. Não houve diferença significativa entres essas sequências na alteração da estrutura terciária da proteína, já que todos os oligonucleotídeos avaliados foram capazes de suprimir, em níveis semelhantes, a fluorescência intrínseca da rPrP (FIGURA 12). A interação com a sequência de maior tamanho D67A e D67s (21 pares de base) parece promover um maior aumento nos valores de LS do que a sequência D44G e D44s (18 pares de base) (FIGURA 12). De fato, vimos por comparação individual que a interação da rPrP23-231 com D44 e D67 realizada com o mesmo lote de proteína apresenta diferenças significativas sobre a agregação da mesma, visto por medidas de LS e análises microscópicas (MACEDO et al., 2012). Os resultados estabeleceram também diferenças significativas entre DNA e RNA (R67) na mudança conformacional e modulação da agregação da rPrP, mostrando que a estrutura do ácido nucleico é importante para dirigir a interação e os efeitos observados (FIGURA 12). A supressão de fluorescência da rPrP nesse experimento pode ser resultado do processo de oligomerização sofrido pela rPrP.

81

FIGURA 12. Efeito de DNAs ou RNA na agregação e estrutura da rPrP. Intensidade de espalhamento de luz (LS) relativo (A) e área do espectro de emissão de fluorescência normalizada (B) da rPrP23-231 a 5 µM titulada com os oligonucleotídeos. Em (A) as amostras foram iluminadas a 320 nm e o LS coletado de 300 a 340 nm. Em (B) a excitação foi de 280 nm e emissão coletada de 300 a 420 nm. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C. Modificado de (MACEDO et al., 2012).

Em nosso trabalho anterior observamos que a região N-terminal da rPrP é responsável por mediar os efeitos de agregação na presença dos DNAs testados (MACEDO et al, 2012). Com isso, no presente trabalho realizamos um ensaio semelhante com a construção da rPrP∆51-90, que não apresenta parte do seu domínio N-terminal 82

(FIGURA 13). Nesse ensaio trabalhamos também com oligonucleotídeos maiores, D442x, e D67-2x, para confirmar nossas suspeitas iniciais de que o tamanho pode influenciar os efeitos de interação com a rPrP. Observamos a supressão de fluorescência da proteína na presença dos oligonucleotídeos, indicando alteração na estrutura terciária da rPrP∆5190

, mas não vimos alterações no espalhamento de luz (LS) da proteína, evidenciando que

eventos como oligomerização e agregação não estavam ocorrendo na presença dessa construção da PrP que apresenta deleções uma parte do domínio N-terminal. Os resultados mostraram que a interação com os oligonucleotídeos afeta a estrutura terciária da proteína mesmo quando não ocorre o evento de oligomerização e nos confirma que o tamanho da molécula é sim importante para guiar a interação, já que as moléculas com o dobro de pares de bases (2x) apresentam maior efeito na alteração da estrutura da proteína (FIGURA 13). Entretanto só o tamanho do oligonucleotídeo não explica o porquê das sutis diferenças observadas quando comparado os efeitos das sequências de menor tamanho de D44 e D67. Possivelmente, a construção PrP∆51-90 não sofre agregação imediata induzida por DNA porque um dos sítios de interação com essa molécula se encontra na região N-terminal da PrP que não está presente nesta construção (LIMA et al., 2006).

83

FIGURA 13. Efeito de DNAs na estrutura terciária e agregação da rPrP∆51-90. Área do

espectro de emissão de fluorescência intrínseca normalizada (painel superior) e intensidade de espalhamento de luz a 320 nm (LS) relativo (painel inferior) da rPrP∆51-90 a 5 µM titulada com os oligonucleotídeos. Painel superior, a excitação foi de 280 nm e emissão coletada de 300 a 420 nm. Painel inferior, as amostras foram iluminadas a 320 nm e o LS coletado de 300 a 340 nm. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

Realizamos também ensaios de supressão de fluorescência na presença de acrilamida para obter informações sobre as estruturas dos agregados da rPrP23-231 formados após a ligação com os diferentes oligonucleotídeos através do cálculo da 84

constante de Stern-Volmer (KSV) (FIGURA 14). Nós observamos que os resíduos de triptofano da rPrP estão mais protegidos do solvente na presença dos oligonucleotídeos avaliados, o que pode ser reflexo do processo de oligomerização da proteína disparado na presença do DNA, mas verificamos também diferenças significativas entre as KSV para rPrP23-231 ligada aos diferentes oligonucleotídeos, sugerindo que os complexos rPrP:DNA provavelmente apresentam estruturas distintas, uma vez que os seus resíduos fluorescentes parecem estar experimentando diferentes ambientes químicos em cada complexo estudado (refletido por diferentes valores de KSV) (TABELA 4). Sete dos oito resíduos de triptofano da rPrP estão localizados no domínio flexível (N-terminal) e, por isso, os distintos valores de KSV entre essas sequências pode ser resultado de diferentes mudanças conformacionais na região N-terminal da proteína ditadas pela interação com DNA.

85

4,0 3,5

A

rPrP23-231 rPrP23-231 + D44G

rPrP23-231 + D44s rPrP23-231 + D44

F0/F

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5

0

20

40

60

80

100

120

Acrilamida [mM] 4,0 3,5

B

rPrP23-231 + D67s rPrP23-231 + D67

3,0

F0/F

rPrP23-231 rPrP23-231 + D67A

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5

0

20

40

60

80

100

Acrilamida [mM] FIGURA 14. Ensaios de supressão de fluorescência da rPrP na presença de DNA. rPrP23-231

a 5 µM (círculo preto) foi incubada com os oligonucleotídeos. Concentrações crescentes de acrilamida foram adicionadas às amostras e a emissão de fluorescência foi coletada (excitação a 280 nm; emissão de 300 a 420 nm). Os valores pontuais referem-se à área do espectro de emissão de fluorescência da proteína normalizado. Uma regressão linear foi realizada em cada condição para que pudesse ser calculada a angulação da reta que reflete o valor da constante de Sterm-Volmer. Modificado de (MACEDO et al., 2012).

86

TABELA 5. Constantes de Stern-Volmer (KSV)

Amostra

kSV (M-1)

rPrP23-231

25.5 ± 1.5

rPrP23-231 + D44

12.6 ± 2.0

rPrP23-231 + D44s

12.4 ± 1.1

rPrP23-231 + D44G

14.1 ± 1.1

rPrP23-231 + D67

14.5 ± 1.5

rPrP23-231 + D67s

5.0 ± 1.0

rPrP23-231 + D67A

9.2 ± 2.5

Modificado de (MACEDO et al., 2012).

Vimos que as sequências D44, D44G, D44s e D67 apresentam um perfil de proteção similar, enquanto as sequências D67A e D67s apresentam diferenças significativas com os resíduos de triptofano bem mais protegidos nessas estruturas. Essas diferenças podem ter sido mascaradas na avaliação da fluorescência intrínseca devido a agregação imediata sofrida pela proteína na presença desses DNAs (FIGURA 12). As sequências D44 e D67 que aparentemente apresentavam efeitos semelhantes na alteração da estrutura terciária da rPrP23-231, revelaram efeitos distintos quando interagiam com a construção da rPrP menos propensa a agregação (rPrP∆51-90) (FIGURA 13). A construção rPrPΔ51-90 pode apresentar um sítio de ligação ao DNA, o primeiro cluster de lisina, mas não sofre os mesmos efeitos sobre a agregação após a incubação com DNA, provavelmente porque essa região se faz importante para manter o N-terminal bem empacotado nos eventos de associação da PrP com PrP necessários para a agregação mais robusta da proteína. Nossos resultados revelaram diferenças entre os oligonucleotídeos que não estão relacionadas com o tamanho ou com o conteúdo de bases nitrogenadas, já que D67 e D67s apresentam resultados distintos, apesar de terem o mesmo tamanho e os mesmos nucleotídeos, porem em posições embaralhadas. Os dados sugerem que a estrutura tridimensional particular adotada pelo oligonucleotídeo em solução pode guiar a interação mais específica com a rPrP, e nesse caso o D67 e D67s devem formar estruturas distintas. Cada complexo rPrP:DNA deve adotar uma conformação particular que somente poderia ser revelada por técnicas de alta-resolução estrutural. 87

6.2. Efeito dos oligonucleotídeos na estrutura secundária da rPrP

Investigamos as mudanças na estrutura secundária da rPrP23-231 após interação com os oligonucleotídeos D44G, D44s, D67A e D67s por dicroísmo circular (CD) e observamos uma alteração no espectro da rPrP, perdendo o típico sinal de α-hélice da rPrP (observado a 222 nm) quando a proteína estava complexada com as sequências de DNA (FIGURA 15). Além do desvio do espectro para estruturas com maior conteúdo de folhas-β, ocorre grande perda de sinal de CD devido ao processo de agregação sofrido pela proteína e por isso não conseguimos estabelecer grandes diferenças entre os oligonucleotídeos avaliados. Os oligonucleotídeos de DNA foram capazes de induzir mudanças na estrutura secundária da rPrP para conformações mais próximas da forma PrPSc, entretanto não visualizamos diferenças significativas entres eles.

Elipcicidade Bruta (miligraus)

20

rPrP23-231 rPrP:D44G rPrP:D44S rPrP:D67A rPrP:D67S

10

0

-10

-20

200

220

240

260

280

300

320

Comprimento de Onda (nm) FIGURA 15. Efeito de DNAs na estrutura secundária da rPrP. Espectro de CD da rPrP23-231 livre (linha preta) a 5 µM e dos diferentes complexos rPrP:DNA (linhas coloridas) na razão molar de 1:1 Os espectros foram coletados imediatamente após incubação da rPrP com o DNA. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

88

6.3. Estabilidade térmica dos complexos rPrP:DNA

Para determinar a estabilidade térmica das estruturas de rPrP formadas na presença de diferentes DNAs, realizamos ensaios de desnaturação por temperatura e acompanhamos o desenovelamento da proteína por medidas de dicroísmo circular (CD) a 210 nm onde a interferência do sinal dos DNAs avaliados nas condições deste experimento era irrelevante (FIGURA 16). Vimos que a rPrP23-231 livre apresenta uma temperatura média de desenovelamento (t1/2) de aproximadamente 69 oC, e se torna mais estável na presença dos oligonucleotídeos D67s, D67A e D44g. A interação com DNA promove a formação de estruturas da rPrP com diferentes graus de estabilidade térmica, dependendo da sequência analisada. O perfil de desnaturação da rPrP na presença de D67A e D67s é bastante semelhante com o valor de T1/2 de aproximadamente 73 oC e 76 o

C, aproximadamente. Já para os oligonucleotídeos D44S e D44G a diferença entre eles

se mostrou mais significativa, com t1/2 de aproximadamente 66

o

C e 78 oC,

respectivamente. Esses oligonucleotídeos apresentam o mesmo tamanho e diferem no conteúdo de bases guanina e citosina (GC), com 44% de GC no D44s e 77% de GC no D44G. Apesar dos achados de que o tamanho da molécula de DNA seja uma característica importante para mediar alterações na estrutura terciária da PrP, vimos que existem padrões mais específicos guiando essa interação e promovendo a formação de estruturas mais estáveis da PrP, já que as sequências de mesmo tamanho como D44s e D44G, promovem a formação de estruturas com estabilidade térmica significativamente distintas (FIGURA 15).

89

1,2 rPrP:D44G rPrP:D44Ss rPrP:D67A rPrP:D67S

Fração desenovelada

1,0 0,8

rPrP23-231

0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2

20

30

40

50

60

70

80

90

Temperatura (ºC)

FIGURA 16. Ensaio de estabilidade térmica da rPrP na presença de DNA. A rPrP23-231 a 5 µM foi incubada com 5 µM dos respectivos DNAs e os valores pontuais de elipticidade bruta a 222 nm foram coletados por medidas de CD em função do gradativo aumento de temperatura. O ponto final a 90o C corresponde a proteína completamente desenovelada. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4.

6.4. Polimorfismo conformacional do DNA

Para verificar se as moléculas dos ácidos nucleicos duplas-fita avaliadas inicialmente nesta tese apresentam diferentes estruturas em solução, utilizamos a técnica de CD. Os resultados mostraram que cada oligonucleotídeo livre adota uma conformação única em solução visto pelas diferenças nos espectros de CD (FIGURA 17).

90

FIGURA 17. Espectro de CD de DNAs livres em solução. O espectro de CD dos oligonucleotídeos livres a 20 µM foi coletado de 320 nm a 190 nm. Os espectros foram coletados imediatamente após a diluição do oligonucleotídeo em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

Alguns dos oligonucleotídeos avaliados parece adotar a forma-B do DNA, caracterizada por um pico positivo entre 260-280 nm e um pico negativo por volta de 245 nm, porém as posições e amplitudes desses picos de CDs diferem entre os oligonucleotídeos, evidenciando seu polimorfismo conformacional (KYPR et al., 2009). A forma-B é a conformação de DNA mais frequentemente encontrada na natureza, onde o pareamento de bases de maneira perpendicular ao eixo da dupla-hélice (IVANOV et al., 1973). A sequência D44G, que apresenta o maior conteúdo de GC (77%) entre os DNAs avaliados, apresenta um espectro diferenciado de CD, com características de transição da forma-B para a forma-A, devido ao desvio do pico positivo desviado para 260 nm, e o pico negativo desviado para 235 nm (KYPR et al., 2009). DNAs sintéticos ricos em GC tendem a formar conformações mais próximas da forma-A, que é conformação constitutiva dos RNAs (TRANTÍREK et al., 2000). D67 e D67s que também apresentam alto conteúdo de GC (67%) apresenta uma característica típica da forma-A: um segundo pico negativo de maior amplitude em 210 nm (TRANTÍREK et al., 2000). As sequências D67, D67S e D44G adotam conformações mais distintas entre 91

os DNAs avaliados, o que pode explicar seus efeitos mais impactantes no ganho de estabilidade da PrP (FIGURA 17). Nossos resultados apresentados até agora sugerem que determinantes estruturais da molécula de ácido nucleico podem estabelecer interações mais específicas com essa proteína.

6.5. Estudo de agregação da rPrP na presença de DNA Já sabemos que a interação da rPrP23-231 com DNA induz a agregação imediata da proteína conforme já foi visto aqui e em estudos anteriores (CORDEIRO et al., 2001; MACEDO et al., 2012; NANDI; LECLERC, 1999). Esses resultados foram obtidos por técnicas como turbidimetria, espalhamento de luz estático e microscopia. A fim de obter maiores informações a respeito do perfil de distribuição de tamanho de agregados da rPrP23-231 formados após a interação com diferentes oligonucleotídeos, utilizamos técnicas mais refinadas como o espalhamento de luz dinâmico (DLS) e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). O resultado de DLS nos mostrou que a proteína livre monomérica apresenta um raio hidrodinâmico de aproximadamente três nanômetros. Conforme era esperado, na presença de DNA a proteína sofre um processo de agregação imediata, apresentando uma distribuição relativamente homogênea de espécies agregadas com tamanho variando entre 600 a 800 nm nas condições analisadas (TABELA 5). Esses resultados mostraram que, em geral, os agregados da rPrP23-231 formados após a interação com os diferentes DNAs, apresentam tamanhos similares e com baixa polidispersividade, somente a ligação com D67s induziu a formação de agregados significativamente maiores o que deve explicar sua maior constante de Stern-Volmer em relação aos demais, visto em ensaios anteriores (FIGURA 14).

92

TABELA 6. Distribuição de tamanho dos complexos rPrP23-231:DNA

Amostra

Raio (nm) pH 7,4

rPrP23-231

2,76 ± 0,62

2

rPrP23-231 + D44

615 ± 14

15

rPrP23-231 + D44s

640 ± 17

20

rPrP23-231

610 ± 25

5

rPrP23-231 + D67

683 ± 10

5

rPrP23-231 + D67s

810 ± 50

10

rPrP23-231

770 ± 30

5

+

Polidispersividade (%)

D44G

+

D67A *As medidas de DLS foram realizadas em pH 7,4 em tampão Tris com 150 mM de NaCl. rPrP23foi usada na concentração de 25 µM, DNA a 25 µM (1:1).

231

Avaliamos também o perfil de distribuição de tamanho de agregados da rPrP23231

formados após interação com o oligonucleotídeo D67 e calculamos suas concentrações

através da técnica de NTA. Os cálculos resultantes do NTA, corroboram os resultados de DLS, mostrando um tamanho médio de 671 +/- 22 nm para os agregados da rPrP formados na presença de D67 (FIGURA 18). Entretanto através dessa técnica que acopla a visualização por lentes de microscopia e os cálculos dos movimentos brownianos para determinar a relação entre a concentração e tamanho de partículas em solução, fomos capazes de observar uma maior distribuição de tamanho (heterogeneidade) desses agregados em relação ao DLS. Uma possível explicação para essa diferença pode estar relacionada com o limite de detecção das técnicas, o NTA nos mostrou que a maior concentração de espécies agregadas apresenta tamanho maior que 1 µm, que está aquém do limite de detecção do DLS e pode ter mascarado seu cálculo de polidispersividade. O NTA também apresenta limite máximo de detecção de 1 µM, entretanto mesmo trabalhando no limite, essa técnica mantém sua sensibilidade para identificar e calcular a 93

concentração de partículas de menores tamanhos (FILIPE; HAWE; JISKOOT, 2010). Todavia, essa técnica não é capaz de calcular o tamanho da PrP, já que seu tamanho está abaixo do limite mínimo de detecção do aparelho, em contraste ao DLS onde podemos calcular o tamanho das amostras purificadas da rPrP de aproximadamente 3 nm. Estudos estruturais mostram a agregação da PrP é altamente influenciada pelo seu domínio N-terminal flexível (FRANKENFIELD; POWERS; KELLY, 2005; ZAHN, 2003). O alto grau de liberdade conformacional da região N-terminal permite que a forma inteira da PrP adote múltiplas conformações oligoméricas mesmo em condições fisiológicas e possa formar agregados maiores e mais organizados do que aqueles formados com a formas truncadas da PrP (FRANKENFIELD; POWERS; KELLY, 2005; WANG; SHAO; HALL, 2016). Embora a região N-terminal da PrP pareça dispensável para propagação de prion, já que o fragmento resistente da PrP, que não contém essa região, é capaz de transmitir a doença in vivo (PRUSINER, 1982), ela está relacionada com a interação com cofatores, como os ácidos nucleicos, e pode guiar o mau enovelamento e agregação da PrP, e impactar na diversidade conformacional da PrPSc (MACEDO et al., 2012; VIEIRA et al., 2014). Estudos de agregação mostram que moléculas carregadas negativamente (poliânions) podem favorecer a agregação da PrP através de um mecanismo de neutralização de cargas da região N-terminal (GROVEMAN et al., 2015). Essa região encontra-se positivamente carregada em pH neutro e forças de repulsão eletrostática impedem sua associação para formação de agregados bem empacotados (GROVEMAN et al., 2015). A compensação de cargas dessa região mediada pela interação não específica entre o DNA com seu esqueleto de fosfato carregado negativamente pode favorecer a aproximação e a associação PrP-PrP e explicar a agregação induzida pelo DNA vista nos nossos resultados com a rPrP inteira. Além disso, mostramos que o DNA é capaz de induzir mudanças conformacionais na proteína, essas alterações podem expor resíduos hidrofóbicos que normalmente estariam escondidos em seu interior e favorecer o processo de agregação (FIGURA 12 e 13).

94

Figura 18. Concentração e tamanho dos agregados da rPrP formados na presença de D67. Através da técnica de NTA foi possível calcular o perfil de distribuição de tamanho com suas respectivas concentrações em solução de agregados da rPrP formados após ligação com D67. A rPrP23-231 na concentração de 5 µM foi incubada com 5 µM de D67. A região em vermelho do gráfico corresponde a variação encontrada entre três medidas experimentais independentes. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4.

6.6. Efeitos da interação do domínio C-terminal da rPrP (rPrP90-231) com DNA

Dando continuidade aos nossos estudos de interação PrP-DNA, nós monitoramos também as mudanças na estrutura terciária e no processo de oligomerização da proteína estudando apenas o domínio C-terminal da rPrP (rPrP90-231). Esse domínio é globular e estruturado, apresentando três α-hélices e duas pequenas folhas-β antiparalelas e corresponde a região da PrP que se torna resistente a digestão com PK (PrPRES) quando convertida em PrPSc (PRUSINER, 1998; ZAHN et al., 2000). Apesar da primeira adição de DNA induzir uma pequena oligomerização da rPrP90-231 visto pelo aumento nos valores de LS, nas adições seguintes com maiores concentrações de DNA a proteína retorna aos seus valores de LS iniciais (FIGURA 19). Nossos resultados mostram que a interação de rPrP90-231 com DNA não é capaz de sustentar a agregação da proteína, corroborando com a ideia de que o domínio N-terminal desenovelado da rPrP é importante para mediar os efeitos de agregação na presença de DNA. Entretanto, mesmo na ausência do domínio Nterminal, a rPrP parece interagir com moléculas de DNA, já que tanto na presença de D44 95

como D67 houve supressão da fluorescência intrínseca da rPrP dependente da concentração do oligonucleotídeo, indicando modificações na estrutura terciária dessa proteína induzidas pela presença de DNA (FIGURA 20). De fato, em estudos de SAXS foi mostrada a existência de pelo menos dois sítios na PrP de interação com DNA, sendo um deles no domínio N-terminal desestruturado e o outro na região C-terminal globular (LIMA et al., 2006)

4 rPrP90-231 + D44 rPrP90-231 + D67

Ls/Lso

3

2

1

0

0

2

4

6

8

Oligonucleotídeo [M]

FIGURA 19. Ligação de DNA não induz agregação da PrP90-231. Área da intensidade de espalhamento de luz (LS) relativo da rPrP23-231 a 5 µΜ titulada com concentrações crescente dos oligonucleotídeos D44 e D67. As amostras foram iluminadas a 320 nm e os valores de LS coletados de 300 a 340 nm. O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

96

800 700

Intensidade (u.a.)

600 500

[D67]

400 300 200 100 0 320

340

360

380

400

420

Comprimento de Onda (nm) 1200

Intensidade (u.a)

1000 800

[D44]

600 400 200 0 320

340

360

380

400

420

Comprimento de onda (nm)

FIGURA 20. Ligação do DNA altera estrutura terciária da rPrP90-231. Espectro de emissão de fluorescência da rPrP90-231 a 5 µΜ titulada com D67 (painel superior) ou D44 (painel inferior). O incremento gradual de 1 µM de ambos os DNAs promove supressão de fluorescência da proteína (excitação foi de 280 nm e emissão coletada de 320 a 420 nm). O experimento foi realizado em tampão Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a 25º C.

97

6.7. Parâmetros físico-químicos da interação da PrP com ácidos nucleicos

Vimos até agora a interação da PrP com ácidos nucleicos por medidas indiretas, como alterações de estrutura e efeitos na agregação e estabilidade dessa proteína quando na presença de diferentes ácidos nucleicos. Para confirmar a ligação entre essas duas moléculas em solução e estimar os parâmetros termodinâmicos dessa interação, como a estequiometria de ligação, a constante de associação e entropia e entalpia desse sistema, utilizamos da técnica de ITC. Fomos capazes de confirmar a interação entre a rPrP murina e os ácidos nucleicos, tanto DNA como o RNA. Inicialmente, avaliamos a interação de proteína recombinante inteira selvagem (rPrP23-231) com os oligonucleotídeos D44, D67 e R67 (FIGURA 20, 21 e 22). Observamos uma típica curva de ligação no ITC, à medida que injetávamos tanto o DNA (FIGURA 21 e 22) como o RNA (FIGURA 23) na célula de amostra contendo rPrP23-231 a 5 µM. Caracterizamos a reação de interação entre essas duas moléculas como exotérmica, visto pelos picos negativos de calor entre cada injeção, indicando que o calor está sendo liberado após a interação. A partir do fitting (ajuste) da curva foi possível calcularmos os parâmetros termodinâmicos dessa interação (TABELA 6). A análise desses resultados nos permitiu concluir que os oligonucleotídeos apresentam alta afinidade pela rPrP23-231, na faixa de micromolar e que a ligação desses ácidos nucleicos na proteína é particular para cada sequência avaliada, visto por diferenças significativas na entalpia padrão, entropia e energia livre do sistema. Encontramos também diferenças relevantes na estequiometria de interação da rPrP com DNA (2 moléculas de PrP para 1 de DNA) e RNA (5 moléculas de PrP para 1 de RNA), o que pode explicar o fato de que a sequência de RNA induz maior agregação da proteína do que as de DNA (FIGURA 12), já que podem aproximar mais moléculas de PrP, favorecendo as interações proteína-proteína e facilitando o processo de agregação. Por comparação entre D44 e D67 vimos que a rPrP apresenta maior afinidade por D67, que pode ser explicado pelo seu maior conteúdo de bases GC, que podem formar um número maior ligações de hidrogênio com a proteína ligante (LUSCOMBE; LASKOWSKI; THORNTON, 2001). Nossos resultados estão em consonância com dados de calorimetria e ressonância plasmônica de superfície obtidos por um outro grupo de pesquisa no estudo de interação PrP recombinante ovina com DNAs, apresentando afinidades semelhantes e a mesma estequiometria de ligação (CAVALIERE et al., 2013).

98

TABELA 7. Parâmetros termodinâmicos da interação da PrP com ácidos nucleicos Complexo

N

rPrP23-231:D44

0.5:1

6.2 ± 2.1

-73.6 ± 4.7

- 216

rPrP23-231:D67

0.5:1

3.3 ± 0.5

-129.4 ± 6.0

- 404

rPrP23-231:R67

0.2:1

8.3 ± 3.9

-29.1 ± 2.9

- 66.1

K (µM)

∆H (kcal/mol)

∆S (cal/mol/grau)

N – estequiometria de ligação PrP:ácido nucleico; K – constante de afinidade; ∆H –variação de entalpia padrão; ∆S – variação entrópica do sistema.

FIGURA 21. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com D44. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:DNA (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset no painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

99

FIGURA 22. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com D67. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:DNA (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset no painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

100

. FIGURA 23. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com R67. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:RNA (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset no painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

Avaliamos também a interação de D44 e D67 com apenas o domínio C-terminal estendido da proteína (rPrP90-231) por ITC (FIGURA 24). Não foi possível estimar os parâmetros termodinâmicos dessa ligação, apesar da reação mostrar liberação de calor em todas as injeções de DNA na célula de amostra contendo a rPrP90-231, a ligação parece ser não específica ou ocorrer em uma faixa de concentração bem mais elevada, já que não foi possível saturar essa ligação nas mesmas condições utilizadas nos experimentos com a proteína inteira. Essa observação corrobora nossos resultados anteriores aonde vimos que a região N-terminal da proteína é fundamental para mediar os efeitos mais pronunciados 101

do DNA na agregação e alteração de estrutura da PrP. Mudanças estruturais na PrP, principalmente no domínio N-terminal e no início da primeira α-hélice são passos fundamentais durante o processo de conversão conformacional da PrPC em PrPSc (HUANG; PRUSINER; COHEN, 1996).

FIGURA 24. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com D44 e D67. O

perfil bruto da curva de ITC com D44 (painel superior) e D67 (painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

Esses resultados nos permitiram concluir que apesar da região C-terminal também poder participar da ligação de DNA, a região N-terminal desestruturada da PrP confere 102

maior afinidade a ácidos nucleicos. Os domínios podem cooperar na ligação com DNA através das seguintes maneiras: i) ligação nos sulcos da dupla hélice do DNA, a partir de interações eletrostáticas (os aminoácidos arginina, lisina e histidina apresentam um papel importante nas interações eletroestáticas) e de van der Waals, entre vários resíduos de aminoácidos da PrP com os grupamentos fosfato e desoxirribose do DNA, e essa ligação pode ser afetada pela conformação da cadeia do ácido nucleico (SEKIYA e et al., 2005); ii) reconhecimento específico da PrP com bases não pareadas do DNA. Esses dois mecanismos podem acontecer simultaneamente ou sequencialmente: a princípio, interações eletrostáticas com o N-terminal podem primeiro aproximar os dois parceiros moleculares, para o segundo passo de estabelecimento de interações mais específicas. A PrP23-231 é altamente básica (pI 9,0), possui onze resíduos de arginina, dos quais oito estão no domínio N-terminal e podem mediar a rápida interação com DNA. A especificidade na ligação deve ocorrer principalmente por ligações de hidrogênio entre a cadeia de aminoácidos da proteína e as bases nitrogenadas do ácido nucleico, nesse caso a arginina tem um papel importante porque pode fazer duas ligações de hidrogênio com a base guanina e aumentar a especificidade de interação com os DNA ricos em GC.

103

6.8. Agregação e toxicologia do peptídeo PrP106-126 na presença de ácidos nucleicos Recentemente, nós caracterizamos a formação do complexo ternário envolvendo o peptídeo humano da PrP que compreende os resíduos 106 a 126, íons Cu+2 e DNA (CHAVES et al., 2014) (APÊNDICE). Esse peptídeo é neurotóxico, altamente amiloidogênico e agrega em pH neutro (JOBLING et al., 2001). A interação do DNA com esse domínio específico da PrP nos incentivou a avaliar seu efeito sobre agregação e toxicidade desse peptídeo. Após a análise da morfologia dos agregados formados pela PrP106-126 sozinha e depois da incubação com DNA e RNA por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), nossos resultados mostram a formação de agregados altamente organizados numa arquitetura fibrilar, característico de estruturas amiloides após 21 dias de incubação. Vimos que esse longo período de incubação (21 dias) era necessário para a agregação amiloidogênica, sem adição de cafatores, do peptídeo PrP106-126. A incubação com DNA e RNA parece inibir a extensão da agregação do peptídeo, visto nas imagens microscópicas de menor aumento (FIGURA 25, coluna da esquerda). Efeito semelhante também foi observado com a interação de DNA com a PrP109-149 por medidas de LS (CORDEIRO et al., 2001). Entretanto a interação com os ácidos nuclecios não é capaz de alterar a morfologia amiloide clássica da PrP106-126, conforme visto nas imagens ampliadas (FIGURA 25, coluna da direita). Seguimos para a avaliação da toxicidade dos agregados em cultura de células N2a (neuroblastoma), os ensaios foram realizados em diferentes tempos de agregação (0, 7, 14 e 21 dias de incubação) (FIGURA 26). Os resultados mostraram que após 14 dias o peptídeo PrP106-126 agregado já apresentava sozinho toxicidade para a cultura de células de neuroblastoma, e a agregação na presença dos ácidos nucleicos parece não alterar essa citotoxicidade, sugerindo que morte neuronal mediada pela PrP106-126 não depende da formação de grandes agregados, numa organização fibrilar amiloide típica do peptídeo, mas sim de espécies intermediárias, possivelmente oligoméricas, dessa via de agregação, já que mesmo a redução da agregação do peptídeo induzida por ácidos nucleicos não foi capaz de reverter sua toxicidade.

B 104

A

C

PrP106-126

PrP106-126 + DNA

PrP106-126 + RNA

FIGURA 25. Morfologia da PrP106-126 na presença de ácidos nucleicos visto por TEM. PrP106-126 livre agregada após 21 dias na concentração de 20 µM; PrP106-126 a 20 µM incubada com 20 µM de DNA (D67) ou RNA (R67). Coluna da esquerda: aumento de 25.000 vezes com barra de escala de 1 µm. Coluna da direita: aumento de 50.000 vezes com barra de escala de 0,5 µm. As barras de escala estão inseridas na figura.

105

FIGURA 26. Ensaio de disfunção celular do peptídeo rPrP106-126 na presença de DNA, RNA. rPrP106-126 foi incubada a 25 µM na razão molar de 1:1 com os oligonucleotídeos (D67 ou R67) e, em seguida, diluída para uma concentração final de 5 µM em cada poço contendo a monocamada de células N2a. A redução do MTT foi avaliada como descrito em Material e Métodos. Os erros das barras representam o desvio padrão de três experimentos independentes. (Estatísticas: NS, não significativo; em relação ao controle: * p < 0.05, ** p < 0.01 *** p < 0.001)

6.9. Efeito do DNA na conversão e propagação de prions Para avaliar o efeito dos DNAs na propagação de prions, realizamos ensaios com cultura de células de neuroblastoma permanentemente infectadas (ScN2a) com duas diferentes cepas de prion, 22L e RML e tratadas com os diferentes oligonucleotídeos. Através de um ensaio de dot-blot quantificamos a formação de PrPres em células ScN2a tratadas com diferentes concentrações dos oligonucleotídeos dupla fita não modificados D44 e D67, e dos oligonucleotídeo dupla fita com a modificação fosforotioato, D44* e D67* (ver Material e Métodos). De maneira muito interessante vimos que os DNAs simples fita com a modificação fosforotioato, D44* e D67*, eram capazes de inibir em até 80 % a formação de PrPres nos ensaios com células infectadas com a cepa 22L, e em mais de 90 % nos ensaios com as células infectadas com a cepa RML (FIGURA 27). Os DNAs não modificados não foram capazes de interferir no acúmulo de PrPres, com a exceção da maior concentração avaliada de D67 (50 µM). A modificação fosforotioato foi uma estratégia realizada para conferir a molécula de DNA maior resistência à digestão por nucleases, esse fato pode explicar a ausência de efeito para os DNAs não modificados, que podem ter sido degradados ao longo do período de incubação com as células. Nossos resultados apresentam os fosforotioatos D44* e D67*

106

como potentes inibidores da formação de PrPres testados em ensaios de células com dois tipos diferentes de cepas infecciosas da PrP.

FIGURA 27. Efeito de oligonucleotídeos de DNA na propagação de prions. Quantificação dos níveis de PrPres em ensaio de cultura de células ScN2a permanentemente infectadas com a cepa 22L (painel superior) ou RML (painel inferior) na presença de diferentes concentrações dos oligonucleotídeos D44, D67, D44*, D67* A barra controle refere-se aos poços nos quais as células foram mantidas na ausência dos oligonucleotídeos e, portanto, corresponde a 100 % de PrPRes. A quantificação dos dotblots foi realizada pela medida da intensidade de cada dot através do software ImageJ. Os resultados representam triplicatas (Estatística *** p < 0.001)

107

Acredita-se que as diferentes cepas de prions apresentem diferentes conformações estruturais da PrPSc e que devem estar relacionadas com os diferentes fenótipos das doenças por prions (AGUZZI; HEIKENWALDER; POLYMENIDOU, 2007), por isso foi importante avaliar e verificar que o efeito do DNA é mantido mesmo trabalhando com diferentes conformações infecciosas. No contexto celular, existem muitas possibilidades para explicar o mecanismo de ação desses oligonucleotídeos como inibidores da propagação de prions; (i) a interação do DNA com a PrPC estabilizando a proteína numa conformação que impede sua conversão estrutural; (ii) diminuição dos níveis de PrPC; (iii) interação e estabilização da PrPSc; (iv) aumento da degradação de PrPSc. Estudos anteriores com fosforotioatos de aproximadamente mesmo tamanho (22 bases) mostraram que esses oligonucleotídeos podem diminuir o nível de PrPC e PrPSc em células ScN2a sem afetar outras proteínas da célula (KARPUJ et al., 2007; KOCISKO et al., 2006). No entanto, a concentração de DNA necessária para diminuir os níveis de PrPC foi bem mais elevada do que a necessária para reduzir os níveis de PrPSc. Como nossos resultados mostram que mesmo em baixas concentrações de fosforotioatos (1 µM), o DNA já atinge sua eficácia máxima, seu mecanismo de ação deve ser por alterações no nível de PrPC. Mais estudos precisam ser realizados para determinar esse mecanismo de ação. O efeito do DNA na propagação de prions parece depender do tamanho do oligonucleotídeo já que moléculas com menos de 15 pares de bases não foram capazes de inibir a formação de PrPSc (KARPUJ et al., 2007), provavelmente porque os DNAs maiores conseguem adotar uma conformação ativa que não é alcançada pelos DNAs de menor tamanho. Outros investigadores encontraram um padrão de dependência de tamanho semelhante, com oligonucleotídeos com 25-28 bases apresentando maior eficácia (KOCISKO et al., 2006). Até agora, havíamos atribuídos aos ácidos nucleicos o papel de ‘vilão’ como facilitadores da conversão e agregação da PrP, mas os estudos mostram que existe um duplo papel do DNA, que podem atuar também como moléculas promissoras para o controle da patogênese da PrP. De fato, foi visto que a infusão intraperitoneal de fosforotioatos aumentou em até três vezes o tempo de sobrevivência de camundongos infectados com a cepa 263K (KOCISKO et al., 2006). Através da técnica de RT-QuIC, também avaliamos o efeito do DNA em modelos de conversão e propagação in vitro da PrP, num sistema livre de células, utilizando como semente para conversão uma quantidade mínima de homogenato de cérebro infectado 108

com a cepa 263K, e como substrato a forma rPrP23-231. Nesse ensaio a sonda fluorescente ThT é utilizada no monitoramento em tempo real da conversão e agregação amiloide de PrP, mas como os ácidos nucleicos interferem na fluorescência dessa sonda, analisamos a influência do DNA na propagação da PrP após 120 horas de reação através da detecção da forma resistente da PrP por Western-Blot (FIGURA 28 e 29). Confirmamos aqui que os fosforotioatos D44* e D67* são capazes de interagir com a PrP recombinante e inibir a conversão total de PrP-sensível em PrP-resistente, visto pela diminuição da marcação com anticorpo especifico para PrP após digestão com PK, e esse efeito depende da concentração de fosforotioatos na reação (FIGURA 28 e 29). Nesse ensaio, mesmo os oligonucleotídeos não modificados, D44 e D67 também foram capazes de modular a conversão da PrP, e encontramos diferenças significativas entre eles, com D44 se mostrando mais potente e mais eficaz em inibir o acúmulo de PrPRES, tendo em vista que mesmo em baixas concentrações já apresentavam atividade (FIGURA 28). Em contrapartida, foi preciso uma maior concentração do oligonucleotídeo D67 para verificar seu efeito como inibidor do acúmulo de PrPres, apesar de ainda encontrarmos uma banda resistente a digestão por PK nesse ensaio (FIGURA 28). Foi a primeira vez que o efeito de DNAs dupla-fita foi avaliada neste tipo de modelo de propagação de PrPSc, mais estudos precisam ser feitos para que possamos determinar o mecanismo de ação e se existem padrões específicos de DNA para promover esse efeito.

109

263K 10-7 com PK

263K 10-7 + D67 com PK 263K 10-7 + D67* com PK 263K 10-7 + D67* com PK

263K 10-7 + D44* com PK 263K 10-7 + D44* com PK 263K 10-7 + D67 com PK

263K 10-7 com PK 263K 10-7 + D44 com PK 263K 10-7 + D44 com PK

NBH sem PK NBH com PK

FIGURA 28. Western blot do produto da reação de RT-QuIC com semente de cérebro de camundongo infectado. Após o término da reação de RT-QuIC, os produtos das reações realizadas em duplicata foram tratados com proteinase K (10 µg/mL) durante uma hora e, em seguida, aplicados em um gel de poliacrilamida. A razão molar PrP:DNA foi de 1:2. Após a corrida eletroforética, o conteúdo do gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e marcadas com anticorpo antiPrP (R20). Os poços com a marcação de NBH corresponde a marcação da proteína celular em ensaios na presença de homogenato de cérebros saudáveis.

110

263K 10-7 + D67* com PK NBH sem PK

263K 10-7 + D67* com PK

263K 10-7 + D67 com PK 263K 10-7 + D67 com PK

263K 10-7 + D44* com PK

263K 10-7 + D44* com PK

263K 10-7 + D44 com PK

263K 10-7 + D44 com PK

NBH sem PK 263K com PK

FIGURA 29. Western blot do produto da reação de RT-QuIC com semente de cérebro de camundongo infectado. Após o término da reação de RT-QuIC, os produtos das reações realizadas em duplicata foram tratados com proteinase K (10 µg/mL) durante uma hora e em seguida, aplicados em um gel de poliacrilamida. A razão molar PrP:DNA foi de 1:5. Após a corrida eletroforética, o conteúdo do gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose, a qual foi incubada na presença do anticorpo R20 (diluição: 1:10.000). Os poços com a marcação de NBH corresponde a marcação da proteína celular em ensaios na presença de homogenato de cérebros saudáveis.

111

6.10.

Efeitos in vivo da inoculação intracerebral de agregados da rPrP na

presença de DNA

Com base em resultados anteriores e naqueles obtidos ao longo desta tese, podemos concluir que dependendo, principalmente, da estrutura da molécula de ácido nucleico, a interação com a PrP vai resultar em diferentes efeitos no mecanismo de agregação da proteína, formando estruturas distintas e potencialmente tóxicas (MACEDO e et al., 2012). Sabemos que o oligonucleotídeo D67 promovia efeitos mais impactantes na agregação e neurotoxicidade da rPrP23-231 (MACEDO e et al., 2012) e por isso, utilizamos essa sequência para iniciar os estudos in vivo desta tese. Para isso, realizamos a injeção intracerebroventricular (icb) de agregados (Grupo Agg) formados imediatamente após interação da rPrP23-231 com D67 em camundongos C57Bl6 machos selvagens, conforme descrito na seção de Metodologia. Um grupo controle foi feito com a injeção de mesmo volume do veículo de diluição (Grupo PBS) e um outro com a injeção isovolumétrica da proteína solúvel livre (Grupo PrP). O modelo mais frequentemente utilizado para estudar doenças por prions em camundongos envolve a inoculação intracerebral de formas infecciosas da PrP, após 4-5 meses do período de incubação; dependendo da cepa de prion utilizada, os camundongos inoculados começam a desenvolver sintomas progressivos sinais clínicos de doenças neurológica, incluindo ataxia (movimentos descoordenados), rigidez da cauda e cifose. Esses efeitos são dependentes da dose inicial PrPSc, se o título infeccioso for muito alto, todos os animais sucumbem a doença (WATTS; PRUSINER, 2014). Os animais avaliados por nós não apresentaram até a data da eutanásia esses sinais clínicos, o que nos levou a realizar um estudo de comportamento dos mesmos. Iniciamos o estudo de comportamento desses animais por diferentes técnicas. Inicialmente para avaliar a habilidade motora desses animais, realizamos testes de comportamento em campo aberto e o pole teste (ver seção de Material e Métodos) (FIGURA 30 e 31). Iniciamos essa avaliação aproximadamente 4 meses após a inoculação nos camundongos. Nossos resultados não mostraram disfunção motora significativa entre os diferentes grupos, mesmo após 8 meses de inoculação.

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FIGURA 30. Pole Teste para avaliar a habilidade motora de camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA. O pole teste realizado após 153 dias da inoculação nos diferentes grupos (n= 14 animais em cada grupo) e monitoramos o tempo que os animais levaram para virar de cabeça pra baixo (tempo de virada) e o tempo que tomaram para descer o pole (tempo de descida). O número experimental foi 14 de animais.

FIGURA 31. Teste de exploração em campo aberto para avaliar a habilidade motora de camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA. O teste de campo aberto foi realizado 137 dias após a inoculação nos diferentes grupos (n= 14 animais em cada grupo) e monitoramos a exploração dos animais contabilizando o número de vezes que cada um deles cruzavam (crossing) os quadrantes delimitados na caixa de cambo aberto, e o número de vezes que eles se levantavam (rearing).

113

No entanto, através do paradigma do medo condicionado, fomos capazes de observar um comportamento alterado dos animais que foram inoculados com o complexo rPrP:D67 em relação aos grupos controles (FIGURA 32). Neste teste, camundongos normais que recebem um choque elétrico no dia anterior apresentam uma reação de freezing e permanecem imóveis quando colocados no dia seguinte naquele mesmo ambiente em que receberam o choque, como resposta de memória associada ao medo. Nosso resultado mostrou que 7 meses após a inoculação, houve um prejuízo no circuito de memória e aprendizado emocional nos animais inoculados com agregados da rPrP induzidos por DNA. Esses agregados que se mostraram tóxicos para culturas de células neuronais (MACEDO et al., 2012) pode estar atuando em neurônios do hipocampo e/ou da amígdala cerebral. Sabe-se que a destruição seletiva do hipocampo causa uma redução significativa da resposta de medo condicionado a um estímulo aversivo (KIM; FANSELOW, 1992) e que a amígdala avalia o nível de ameaça representado pelos sinais de perigo e, por isso, lesões na sua estrutura atenuam as reações a estímulos condicionados e incondicionados (PHILLIPS; LEDOUX, 1992).

FIGURA 32. Teste do medo condicionado em camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA. O teste foi realizado nos animais 182 dias após a inoculação (n= 12 animais em cada grupo). Freezing está relacionado com circuitos de memória e aprendizado emocional. ***Diferença significativa em relação aos grupos controle (PBS e PrP) p < 0.05 (One-way ANOVA, Tukey Test).

Avaliamos também o comportamento ansioso desses animais através do teste de plus-maze elevado (FIGURA 33). Nesse teste, a ansiedade é avaliada pela preferência do 114

camundongo por ambientes escuros e pelo medo não-condicionado de altura/espaços abertos. Nossos resultados mostraram um comportamento ansioso apenas no grupo de animais que receberam o complexo rPrP:D67 (FIGURA 33). Os estudos do circuito neural de ansiedade ainda são bastante controversos, mas muitas evidências apontam para uma importante a participação da amígdala cerebral (HYDE et al., 2011). Apesar de não termos notado alterações na habilidade motora dos animais, visto por diferentes testes comportamentais, encontramos alterações psicopatológicas de alta significância (pelos mais rigorosos testes de estatísticas) apenas no do grupo de animais que receberam os agregados da PrP formados na presença do oligonucleotídeo D67. Verificamos um déficit inicial de funções cognitivas nesses animais que podem estar ligados com a patogênese da PrP. De fato, camundongos experimentalmente infectados com prions apresentam mudanças em comportamento motivacionais muito antes do aparecimento de déficit motor (CUNNINGHAM et al., 2005; GUENTHER et al., 2001). Os primeiros sintomas em diversas doenças neurodegenerativas incluem mudanças de personalidade como ansiedade, depressão, perda de memória e confusão (LEVENSON; STURM; HAASE, 2014).

FIGURA 33. Teste do plus-maze elevado em camundongos C57BL6 após inoculação intracerebroventricular do complexo rPrP:DNA. O teste foi realizado nos animais 213 dias após a inoculação (n= 7 animais em cada grupo). **Diferença significativa em relação aos grupos controle (PBS e PrP) p < 0.01 (One-way ANOVA, Tukey Test).

Sabemos que a inoculação de prions sintéticos que promovem a manifestação de alguns efeitos subclínicos em camundongos podem se tornar altamente agressivos e 115

infecciosos após a inoculação de segunda passagem, ou seja, a partir da inoculação de extrato de cérebro de camundongos que receberam a primeira inoculação de agregados da PrP (DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003). Em um estudo recente, foi visto que na presença de RNA e de lipídeos era possível estimular a propagação de prion e que a inoculação de primeira passagem aparentemente não manifestava os sintomas e não levava os animais a óbito, entretanto a partir da segunda passagem todos os animais morreram com período de incubação bem próximos das doenças por prions (DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003). O efeito da inoculação de segunda passagem, quando o extrato de cérebro de um primeiro animal inoculado com prion é usado para infectar um segundo animal saudável, é quase sempre mais sintomático e debilitante (COLLINGE; CLARKE, 2007). A explicação desse fato pode estar relacionada à presença de fatores celulares adjuvantes do processo de conversão presente no cérebro do primeiro camundongo infectado que facilitariam a formação de estruturas anômalas mais tóxicas e mais infecciosas para uma segunda infecção em outro animal (DELEAULT et al., 2012). Ainda não temos na nossa universidade um laboratório com o nível de segurança exigido para trabalhar com potenciais prions infecciosos e, por isso, escolhemos eutanasiar esses animais e congelar seus cérebros para posterior estudo de inoculação de segunda passagem. Atualmente estamos realizando um novo estudo in vivo de inoculação de primeira passagem com agregados formados após a interação rPrP-DNA em camundongos suíços e iniciamos a avaliação comportamental com um menor tempo após a inoculação, pois acreditamos que efeitos mais agudos podem ser observados após a inoculação desses agregados. Os ensaios precisam ser repetidos mais nossos resultados preliminares mostram diferenças significativas na atividade motora dos animais que receberam agregados da rPrP com DNA.

De fato, foi visto que após um dia de inoculação

intracerebral de PrPSc era possível detectar atividade de seeding no líquido cefalorraquidiano utilizado em reação de conversão pela técnica de RT-QuIck, essa atividade alcançava um platô semanas antes do aparecimento dos primeiros sintomas. Reações já estão acontecendo a nível de SNC um dia após a inoculação (ORRÙ et al., 2012). Por isso é importante avaliar se os agregados da PrP formados na presença de DNA apresentam efeitos agudos. Esses resultados in vivo fornecem fortes evidências à hipótese inicial levantada pelo nosso grupo de pesquisa em 2001 de que os ácidos nucleicos podem auxiliar o processo de conversão conformacional da PrP, atuando como uma espécie de cofator, 116

disparar o processo de agregação da proteína, com potencial formação de estruturas tóxicas e infecciosas que podem levar a morte neuronal e gerar danos cognitivos em camundongos saudáveis.

6.11. Seleção de aptâmeros de DNA contra a rPrP90-231 Na última parte deste primeiro capítulo, realizamos a seleção de aptâmeros de DNA contra o domínio estruturado da rPrP murina, compreendendo os resíduos 90-231 (rPrP90-231) através da técnica de SELEX com pequenas modificações (ver seção Material e Métodos) a fim de discutir o potencial terapêutico e de diagnóstico dessas moléculas. O número crescente de publicações reflete o potencial dos aptâmeros, que estão se tornando uma importante ferramenta na biotecnologia como candidatos para substituir os anticorpos em aplicações terapêuticas, diagnósticas e biotecnológicas. Diferente de anticorpos, o desenvolvimento dos aptâmeros não depende de animais e, a princípio, qualquer molécula serve como alvo. Além de apresentar alta afinidade e especificada contra seu alvo, os aptâmeros também podem ser facilmente modificados para suas respectivas aplicações. Em estudos prévios, três diferentes sítios de interação da PrP com DNA foram identificados, por nosso grupo e por outros, sendo: dois clusters de lisina localizados no domínio N-terminal desestruturado, entre os aminoácidos 25 a 34 e 101 a 110 na PrP ovina (MERCEY et al., 2006) e um terceiro sítio no domínio C-terminal globular (região 121-231 na PrP de camundongo), no qual os aminoácidos envolvidos ainda não foram bem estabelecidos (RHIE et al., 2003; LIMA et al., 2006). Em um estudo posterior, foi identificado que o primeiro cluster de lisina, compreendendo a sequência de aminoácidos KKRPK é importante para mediar a ligação da rPrP humana com ácidos nucleicos (YIN

et al., 2008) Escolhemos a construção rPrP90-231 como alvo molecular na seleção de aptâmeros de DNA para a PrP devido a algumas características a respeito da sua interação com oligonucleotídeos de DNA vista nesta tese. Vimos que esse domínio isolado da rPrP pode ligar pequenas moléculas de DNA, porém com uma menor afinidade de ligação do que aquela vista para a interação da rPrP inteira com DNA (FIGURA 24). Além disso, vimos que os efeitos na agregação e na alteração de estrutura da PrP induzidos por DNA são bem menos pronunciados utilizando apenas essa região, porque o domínio N-terminal intacto é importante para mediar esses efeitos. Acreditamos que encontrar 117

oligonucleotídeos de alta afinidade por essa região pode nos dar novas informações importantes a respeito da interação PrP-DNA e além disso garantir o encontro de sequência bem mais específicas já que a construção inteira, a princípio, parece ligar qualquer molécula de ácido nucleico com alta afinidade (faixa micromolar), conforme vimos nos ensaios de calorimetria desta tese (FIGURAS 21, 22 e 23). O potencial uso de aptâmeros no diagnóstico de prions exige uma alta seletividade desse ligante. A partir da técnica de SELEX fomos capazes de selecionar e amplificar aptâmeros contra a rPrP90-231 que foram eluídos em concentrações crescentes de NaCl. É possível verificar que as sequências eluídas apresentam massa esperada, de acordo com a biblioteca inicial de aptâmeros utilizada contendo em torno de 50 nucleotídeos incluindo com os primers (FIGURA 34). Esses aptâmeros foram então inseridos em um vetor de clonagem apropriado para sua amplificação, isolamento e sequenciamento. As colônias que cresceram após a clonagem são consideradas positivas para os aptâmeros porque somente a inserção de uma sequência de DNA no genoma desse vetor bacteriano permitiria seu crescimento em meio de cultura. Crescemos cada colônia aptâmeropositiva individualmente e isolamos os plasmídeos. Avaliamos a pureza dos plasmídeos isolados por separação em gel de agarose 2 % (FIGURA 35). Nesse gel podemos observar que os plasmídeos apresentavam tamanho esperado em torno de 3 kilobases, a presença de bandas maiores mostram que os plasmídeos podem estar em diferentes graus de condensação, associados ou não. Em análise do gel podemos ver que alguns plasmídeos apresentam maior grau de pureza que outros. Entretanto como esses plasmídeos não foram linearizados nesse gel com enzimas de restrição especificas para esse vetor, não fomos capazes de retirar informação mais relevantes a respeito do nosso inserto (aptâmeros). Dentre os 22 plasmídeos que obtivemos e isolamos, selecionamos 10 aleatoriamente para um ensaio de amplificação por PCR utilizando os primers T3 e T7 proveniente do kit de clonagem. A análise do gel com o produto de PCR nos mostrou insertos com tamanho compatíveis com a presença dos aptâmeros e dos primers da biblioteca e do kit de clonagem (FIGURA 36). O resultado do gel nos mostra que algumas bandas não estão puras o que pode acontecer, caso os aptâmeros se associem por complementaridade de base, em diferentes estruturas terciárias e por isso podem apresentar diferentes tamanhos. Posteriormente, todas as amostras dos 22 plasmídeos foram encaminhadas para sequenciamento. Entretanto alguns eletroferogramas não ficaram bons devido a presença 118

de mais uma banda amplificada como produto da reação de PCR. Aqueles que apresentavam uma banda pura de inserto amplificado mostraram melhor qualidade de sequenciamento. Por isso, dentre os 23 resultados de sequenciamento, apresentaremos apenas aqueles que obtiveram melhor qualidade no eletroferogramas e que também apresentavam compatibilidade no sequenciamento do par ‘foward e reverse’, que é feito individualmente, com os primers foward e reverso, respectivamente.

FIGURA 34. Gel de agarose a 2% dos aptâmeros para rPrP90-231 (C-terminal estendido) eluídos em gradiente de concentração salina. 5 µL das amostras eluídas em diferentes concentrações de NaCl (variando de 1.0 M a 1.5 M com incrementos de 100 mM) foram aplicados por PCR com os primers da biblioteca de aptâmeros e o produto de PCR foi analisado em gel de agarose. Os poços identificados como 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5a e 1.5b identificam a concentração molar de NaCl em que os aptâmeros foram eluídos. Utilizamos a biblioteca de aptâmeros com controle positivo (+) na reação de PCR, e a adição de água como controle negativo (-). Utilizamos o padrão de peso molecular Fast DNA ladder (Invitrogen).

119

FIGURA 35. Gel de agarose a 2 % dos plasmídeos obtidos por miniprep após

clonagem dos aptâmeros. Os aptâmeros eluídos com 1.5 M de NaCl foram clonados em vector de bactéria e após crescimento individual de cada colônia aptâmero positiva, isolamos os plasmídeos de 12 colônias distintas por Miniprep (P1 a P12). 5 µL de cada plasmídeo foram aplicados em cada poço. Utilizamos o padrão de peso molecular Fast DNA ladder (Invitrogen).

FIGURA 36. Gel de agarose a 2 % dos aptâmeros isolados para rPrP90-231 (C-terminal

estendido). 5 µL do produto amplificado de PCR de amostras contendo os plasmídeos indicados que foram isolados após clonagem. Aplicamos o vetor vazio em um dos poços (vector) e, como controle negativo, usamos água ultra pura ao invés de DNA na reação de PCR. Utilizamos o padrão de peso molecular PCR Makers (Promega).

120

6.12.

Sequenciamento dos aptâmeros isolados

As amostras contendo os plasmídeos clonados e isolados com os aptâmeros contra rPrP90-231 foram encaminhadas para sequenciamento na plataforma PDTIS da FIOCRUZRJ. A partir do resultado de sequenciamento, realizamos o alinhamento das sequências obtidas com os primers específicos para a biblioteca dos aptâmeros, o foward 5’GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-3’ GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA-3’

ou e

suas

reverso respectivas

5’sequências

complementares (FIGURA 37). Apresentamos 4 eletroferogramas obtidos no primeiro sequenciamento com as sequências de dois novos aptâmeros, que chamamos de A8 e A9, eles estão identificados em destaque (região central em preto) na figura (FIGURA 38).

A8 – foward

A8 – reverse

A9 – foward

A9 – reverse

FIGURA 37. Alinhamento das sequências dos aptâmeros A8 e A9 com os primers.

121

(A) A8 - foward

(B) A8 - reverse

(C) A9 – foward

(D) A9 - reversa

FIGURA 38. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos aptâmeros A8 e A8.

Conseguimos um excelente alinhamento com os primers dos aptâmeros, validando a técnica de SELEX e clonagem. Analisando os alinhamentos foi possível concluir que as sequências foward e reverse obtidas individualmente de cada um dos 122

aptâmeros A8 e A9 possuem alto grau de complementaridade, 72 e 88%, respectivamente, o que validou o sequenciamento. Poucos nucleotídeos destoaram e tiveram que ser corrigidos através da escolha do eletroferograma (foward ou reverse) de maior qualidade e bem resolvido na região daquele nucleotídeo. Para identificar os erros utilizou-se o programa Jalview para alinhar as sequências complementares, onde as regiões idênticas estão marcadas em azul (FIGURA 39). Sequência A8

Sequência A9

FIGURA 39. Alinhamento das sequências complementares de A8 e A9.

Num segundo sequenciamento obtivemos eletroferogramas de melhor qualidade onde fomos capazes de identificar e selecionar mais 8 novos aptâmeros contra a rPrP90231

. O mesmo processo de análise foi utilizado para essas frações onde após alinhamento

compatível com os primers do aptâmero, determinamos as sequências foward e reverse dos aptâmeros A1, A2, A3, A4, A5, A6 e A7 (FIGURA 40, 41, 42 e 43).

123

A1 – Foward: ACG CGC ACT CCT ATA ATA ACT TGG G

A1 – Reverse: CCC AAG TTA TTA TAG GAG TGC GCG T

A2 – Foward: CCG CGT ACA ATC GAG CTC GGG TGT C

A2 - Reverse GAC ACC CGA GCT CGA TTG TAC GCG G

FIGURA 40. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos

aptâmeros A1 e A2.

124

A3 – Foward GCC GTG GAA GGG TCT GTT ACC ACC A

A3 – Reverse TGG TGG TAA CAG ACC CTT CCA CGG C

A4 – Foward AGC CAG GTC GCG CTG TTT AGG CCC A

A4 – Reverse TGG GCC TAA ACA GCG CGA CCT GGC T

FIGURA 41. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos

aptâmeros A3 e A4.

125

A5 – Foward CGA GAA TCG CCG GGA TCA GCA GAC C

A5 – Reverse GGT CTG CTG ATC CCG GCG ATT CTC G

A6 - Foward CCA ACA CCA CTA GGC TCA TGA TCT G

A6 – Reverse CAG ATC ATG AGC CTA GTG GTG TTG G

FIGURA 42. Eletroferograma obtido para a análise de sequenciamento dos

aptâmeros A3 e A4.

126

A7 – Forward TCG GGT CTG TAT CGA CCC TTG CCG G

A7 - Reverse CCG GCA AGG GTC GAT ACA GAC CCG A

FIGURA 43. Eletroferograma obtido na análise de sequenciamento de aptâmero A7.

TABELA 8. Sequência dos aptâmeros selecionados contra a PrP90-231

Aptâmeros

Sequência (5’-3’)

A1

CCGCGTACAATCGAGCTCGGGTGTC

A2

GCCGTGGAAGGGTCTGTTACCACCA

A3

ACGCGCACTCCTATAATAACTTGGG

A4

AGCCAGGTCGCGCTGTTTAGGCCCA

A5

CGAGAATCGCCGGGATCAGCAGACC

A6

CCAACACCACTAGGCTCATGATCTG

A7

TCGGGTCTGTATCGACCCTTGCCGG

A8

TTCAGCCGCGGAACACGACACACTT

A9

TGGCCGGAGTTGGGTACACTACCGT

127

No gel de agarose dos aptâmeros havíamos notado que muitos deles apresentavam mais de uma banda amplificada, o que explica a menor resolução de alguns eletroferogramas, provavelmente porque eles estão se associando entre si. De fato, esse é um achado interessante, porque em estudos de seleção de aptâmeros contra a PrP realizados por outros grupos, o maior consenso entre os diferentes aptâmeros parece ser estrutural, com a formação de estruturas G-quadruplex por associação de dois, três ou quatros fitas de aptâmeros em uma única estrutura de DNA (CAVALIERE et al., 2013; MASHIMA et al., 2013; PROSKE et al., 2002). Até agora não encontramos através do alinhamento um padrão de sequência primária do aptâmeros que governe a interação com a PrP. De fato, entre os aptâmeros já selecionados contra a PrP inteira de diferentes espécies obtidos por diferentes grupos, as comparações das sequências não puderam revelar um padrão óbvio que fosse compartilhado para todos os aptâmeros específicos para PrP, o que não significa que esse padrão não exista. Isso nos impulsionou a realizar uma busca também no que se refere à estrutura dos aptâmeros. Análises de dados da literatura mostraram que muitos aptâmeros da PrP compartilham o potencial de formar estruturas em quadruplex de guanina. Weiss e colaboradores observaram que 30 % dos aptâmeros caracterizados pelo seu grupo continham repetições de tripletos de guanosina (GGG….GGG….GGG…GGG), levando os autores a sugerirem que esses aptâmeros se enovelassem em quadruplex de guanina (WEISS et al., 1997). Vários outros aptâmeros de DNA ou RNA contra PrP contém pelo menos quatro dinucleotídeos GG separados em sua sequência inteira (MERCEY et al., 2006; SEKIYA et al., 2005; TAKEMURA et al., 2006). Por essa razão, não podemos descartar a possibilidade que esses aptâmeros também possam adotar a estrutura de quadruplex, que não é necessariamente intramolecular, mas pode ser formada também por dimerização ou trimerização das fitas de ácido nucleico (BOCHMAN; PAESCHKE; ZAKIAN, 2012). Quadruplex de guanina são motivos estruturais compostos por duas ou mais tétrades de guanosinas coplanares (o quarteto-G) que estão empilhadas no topo de cada uma. Essas estruturas estão presentes numa significante fração de RNA mensageiros e podem representar um motivo de reconhecimento comum, uma vez que foram encontrados em aptâmeros contra diferentes proteínas (BOCHMAN; PAESCHKE; ZAKIAN, 2012). A PrP apresenta alta afinidade por G-quadruplex, como o R12 que inclusive já teve sua estrutura tridimensional definida por técnicas de alta-resolução como RMN, tanto livre em solução como complexado com peptídeos da PrP na região Nterminal (HAYASHI et al., 2014; MASHIMA et al., 2009, 2013). Foi visto que o R12 128

pode formar quadruplex a partir da associação intermolecular de duas fitas de DNA (MASHIMA et al., 2013). Atualmente, estamos buscando as sequências dos aptâmeros identificados nesta tesa dentro do genoma de diferentes espécies para ver se eles podem estar relacionadas com algum gene em especial. 6.13.

Parâmetros termodinâmicos de interação de A1 e A2 com rPrP

Para validar os aptâmeros A1 e A2 para futuras aplicações, calculamos os parâmetros termodinâmicos de interação com a rPrP23-231 e o com o domínio C-terminal estendida PrP90-231 através da técnica de ITC. Observamos uma curva típica de ‘binding’, confirmando a interação dessas sequências com a rPrP90-231, o alvo molecular contra a qual os aptâmeros foram selecionados e fomos capazes de estimar a constante de afinidade na faixa de nanomolar para o A1 (aproximadamente 200 nM) e micromolar para A2 (aproximadamente 3 µM) (FIGURA 44 e 45). A ligação era mantida mesmo com a proteína inteira (FIGURA 46 e 47), mas não conseguimos realizar um ajuste adequado da curva para calcular os parâmetros termodinâmicos de interação, entretanto podemos afirmar pelo perfil da curva que afinidade desses aptâmeros pela proteína inteira é maior do que pelo domínio contra o qual foram selecionados. Esses achados estão em acordo com a nossa proposta em realizar o SELEX contra o domínio C-terminal da PrP para garantir a seleção de sequência bem mais especificas contra essa proteína, lembrando que a proteína inteira apresenta outros sítios de ligação ao DNA na região N-terminal e, por isso, o aumento da afinidade do aptâmero para a construção inteira. Os oligonucleotídeos D44 e D67 inicialmente investigados nesta tese foram selecionados aleatoriamente e não apresentaram afinidade contra o domínio C-terminal da rPrP na faixa de concentração avaliadas neste trabalho. A técnica de SELEX se comprovou eficiente na seleção de ligantes com alta afinidade contra um determinado alvo e que podem servir como interessantes ferramentas para o desenvolvimento de novas abordagens de diagnóstico e terapia contra as doenças por prions, além de facilitar a compreensão dos estudos de interação de PrP com ácidos nucleicos. A afinidade da PrP por G-quadruplex ocorre na faixa de nanomolar (MASHIMA et al., 2009), assim como os identificados por nós. Nossas análises de CD revelaram que os oligonucleotídeos avaliados neste trabalho não formam estrutura de quadruplex, com 129

exceção de D44G (FIGURA 17). Ainda não avaliamos a afinidade de interação da rPrP com D44G, mas vimos que os oligonucleotídeos D44, D67 e R67 apresentam menor afinidade pela proteína do que os G-quadruplex identificado por outros grupos. Acreditamos que a interação de alta afinidade e especificidade por esse domínio da rPrP pode estabilizar essa conformação e impedir que ela seja convertida na forma patológica.

FIGURA 44. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com A1. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:A1 (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM. O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

130

FIGURA 45. Curva de ITC obtida para interação da rPrP90-231 com A2. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:A2 (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

131

Figura 46. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com A1. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:A1 (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

132

Figura 47. Curva de ITC obtida para interação da rPrP23-231 com A2. O perfil bruto da curva de ITC (painel superior) e os valores integrados de calor plotados em função da razão molar PrP:A1 (painel inferior) são mostrados juntos com os parâmetros termodinâmicos de interação (inset painel inferior). O experimento foi realizado com a proteína a 5 µM em tampão cacodilato de sódio 20 mM, pH 7,4 a 25º C.

133

6.14. Agregação da rPrP23-231 induzida por aptâmeros Para uma avaliação do efeito dos aptâmeros na agregação da proteína prion inteira, inicialmente acompanhamos a cinética de agregação da proteína por medida de espalhamento de luz estático (LS) a 320 nm (FIGURA 48). No início de cada cinética adicionamos uma diminuta concentração dos aptâmeros A1 ou A2 (100 nM) e fomos capazes de observar a oligomerização/agregação imediata da proteína visto pelo aumento nos valores de LS. Interessantemente, vimos que essa agregação é naturalmente revertida após 24 horas mesmo sob agitação e que uma segunda adição de maior concentração dos aptâmeros A1 ou A2 não é capaz de induzir novamente o processo de agregação da rPrP23231

. Já havíamos notado nos ensaios com os oligonucleotídeos dupla-fita que a primeira

adição do DNA parece ser determinante para ditar os níveis de agregação (FIGURA 12 e 19). Diferente dos aptâmeros A1 e A2 a agregação induzida por D67 e D44 pode ser apenas parcialmente revertida mesmo após 7 dias de incubação (MACEDO e et al., 2012). Uma explicação para essa observação é que a primeira interação da proteína com DNA já promove mudanças na estrutura da PrP, que pode perder totalmente ou parcialmente a afinidade pelo DNA, dependendo de quão drástica for a alteração conformacional, e por isso as próximas adições de DNA são inexpressivas ou de pouco efeito, dependendo da sequência avaliada. Não acreditamos que a PrP já tenha saturado sua afinidade pelo DNA na primeira adição, porque medidas diretas de interação como calorimetria (FIGURA 21 e 22) ou indiretas como fluorescência (FIGURA 12, 19 e 20) e CD (FIGURA 15) não suportam essa ideia.

134

FIGURA 48. Cinética de agregação da rPrP23-231 após ligação com aptâmeros. O espalhamento de luz a 320 nm foi acompanhado em função do tempo. Logo no início da cinética é adicionado 0.1 µM de A1 (linha verde) ou A2 (linha azul) na solução de rPrP23-231 a 5 µM. Uma nova adição de 0.5 µM de A1 ou A2 é feita após 24 horas de cinética. As setas indicam o momento de adição do DNA.

Através da técnica de NTA, visualizamos e calculamos a concentração e o tamanho dos oligômeros e agregados da PrP formados ineditamente após a ligação ao aptâmero (Figura 49 e 50). A proteína livre monomérica apresenta um raio hidrodinâmico de aproximadamente três nanômetros visto por DLS, e na presença de A1 (Figura 49) e A2 (FIGURA 50) a proteína sofre agregação imediata que é rapidamente desfeita, apresentando uma distribuição heterogênea de espécies agregadas, apresentando um tamanho médio de 165 nm e 307 nm, após interação com A1 e A2, respectivamente.

135

FIGURA 49. Nanoparticle Tracking Analysis da interação da rPrP23-231 com A1. Através da técnica de NTA foi possível calcular o perfil de distribuição de tamanho com suas respectivas concentrações em solução de agregados da rPrP formados após ligação com A1. A rPrP23-231 na concentração de 5 µM foi incubada com 5 µM de D67. O gráfico mostra a média experimental com a região em vermelho que corresponde a variação encontrada entre três medidas experimentais independentes. Uma tabela com o resumo dos dados obtidos é apresentada.

136

FIGURA 50. Nanoparticle Tracking Analysis da interação da rPrP23-231 com A2. Através da técnica de NTA foi possível calcular o perfil de distribuição de tamanho com suas respectivas concentrações em solução de agregados da rPrP formados após ligação com A2. A rPrP23-231 na concentração de 5 µM foi incubada com 5 µM de D67. O gráfico mostra a média experimental com a região em vermelho que corresponde a variação encontrada entre três medidas experimentais independentes. Uma tabela com o resumo dos dados obtidos é apresentada.

Em ensaios de TEM, vimos que os agregados da rPrP23-231 formados na presença dos aptâmeros A1 e A2 apresentam morfologia anular, e espécies esferoides preenchidas, identificamos também a presença de agregados com alto nível de organização semelhantes as fibras amiloides (FIGURA 51), características bastante diferentes daquela vista para a agregação induzida por D44 e D67 que apresentam morfologia amorfa (MACEDO et al., 2012). Em contrapartida, para a interação com a rPrP90-231, vimos que A1 e A2 promove a formação de uma população heterogênea de pequenas espécies oligoméricas de morfologia amorfa (FIGURA 52), mostrando, mais uma vez, que a região N-terminal da PrP é importante para guiar a agregação mais robusta da proteína. 137

23-231

rPrP + A1

23-231

rPrP + A2

FIGURA 51. Morfologia da rPrP23-231 na presença dos aptâmeros A1 e A2. A rPrP23-231 a 5 µM foi incubada com A1 (painel superior) e A2 (painel inferior) em concentração equimolar. A barra de escala foi inserida em cada imagem.

138

90-231

rPrP

+ A1

90-231

rPrP

+ A2

FIGURA 52. Morfologia da rPrP90-231 na presença dos aptâmeros A1 e A2. A rPrP23-231 a 5 µM foi incubada com A1 (painel superior) e A2 (painel inferior) em concentração equimolar. A barra de escala foi inserida em cada imagem.

139

CAPÍTULO 2 – MODELO DE AGREGAÇÃO AMILOIDE DA PrP IN VIVO DENTRO DE BÁCTERIAS

7. CAPÍTULO 2 - INTRODUÇÃO A agregação de proteínas é um dos principais eventos responsáveis pela deflagração de diversas doenças neurodegenerativas, incluindo as doenças de Parkinson (DP), de Alzheimer

(DA)

e

as

próprias

doenças

por

prions

(EETs)

(KNOWLES;

VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). O mau enovelamento de uma proteína particular, como a α-sinucleína para a DP, o peptídeo β-amiloide para a DA e a PrP para as EETs pode promover a agregação da proteína, levando ao seu acumulo anormal dentro das células ou nos tecidos e órgãos. Independente da sequência ou estrutura da proteína particular, o processo de agregação normalmente procede de maneira altamente organizada para formação de depósitos amiloides nessas doenças (KNOWLES; VENDRUSCOLO; DOBSON, 2014). Agregados de proteínas também podem ser encontrados na forma de corpos de inclusão (IBs). Os IBs são formados a partir da agregação de uma determinada proteína e representam uma importante estratégia dos organismos procariotos para isolarem proteínas mal enoveladas e proteínas exógenas, ou ainda, para controlar a concentração celular de algumas proteínas (KOPITO, 2000). Apesar de serem encontrados com maior frequência em bactérias, essas estruturas não são exclusivas dos procariotos (KAGANOVICH; KOPITO; FRYDMAN, 2008; OGRODNIK et al., 2014). A produção de uma proteína recombinante em bactéria acontece após a inserção de um plasmídeo contendo o gene da proteína de interesse dentro do genoma bacteriano e, muitas vezes, resulta na formação de corpos de inclusão ricos em agregados da proteína em questão (KOPITO, 2000). A proteína agrega, não só devido à alta concentração alcançada no momento da indução de sua expressão, mas também pelo novo microambiente celular que ela experimenta, diferente do seu organismo de origem, com alterações de pH, osmolaridade, e temperatura, por exemplo (TAYLOR et al., 1986). Os corpos de inclusão são compostos principalmente pela proteína heteróloga, que pode corresponder a até 90% da proteína total embebida nesses corpos que podem conter

140

conformações da proteína enovelada nativa, assim como, espécies parcialmente enoveladas e desenoveladas (FIGURA 53).

FIGURA 53. Conformações adotadas por proteínas recombinantes dentro de bactérias. A cadeia polipeptídica nascente pode se enovelar ou permanecer parcialmente ou totalmente desenovelada. Essas estruturas podem se associar formando os IBs, nas quais múltiplas conformações coexistem. Há um equilíbrio dinâmico entre as frações solúveis e insolúveis, promovidas pela ação de chaperonas moleculares. Portanto, tanto as espécies proteicas funcionais como as inativas estão presentes em formas solúveis e/ou embebidas nos IBs (SABATE e et al., 2010).

Por muito tempo, os corpos de inclusão foram vistos como depósitos de agregados amorfos, sem estrutura e sem atividade, formados apenas pelo “colapso hidrofóbico” de cadeias polipeptídicas desenoveladas ou parcialmente enoveladas (FINK, 1998). Atualmente, grupos independentes vêm mostrando que a formação dos corpos de inclusão não é dirigida por contatos hidrofóbicos genéricos, mas sim por processos bem específicos, onde contatos intermoleculares são estabelecidos através de regiões selecionadas da cadeia polipeptídica. Essa especificidade foi inicialmente demonstrada através da expressão simultânea de duas proteínas diferentes com alta propensão à agregação na mesma célula, que levou a formação de dois agregados distintos, com diferentes composição e morfologia (HART; RINAS; BAILEY, 1990). A co-expressão pode resultar também na formação de um tipo único de agregado por célula, porém com diferente distribuição espacial das duas proteínas recombinantes, nesse caso a proteína mais amiloidogênica fica embebida no interior do núcleo do IB e a proteína menos 141

propensa à agregação encontra-se ancoradas na superfície do agregado (DE GROOT; SABATE; VENTURA, 2009; MORELL et al., 2008). Diferentes grupos de pesquisa demonstraram que a expressão de diferentes proteínas recombinantes, como enzimas e proteínas fluorescentes, podem manter conformações nativas e funcionais mesmo quando embebidas nos IBs (PARK; PARK; CHOI, 2012; PETERNEL; KOMEL, 2011; SABATÉ et al., 2009). Além disso, os IBs formados por proteínas amiloidogênicas dentro de bactéria apresentam características comuns com os agregados altamente organizados e, em muitos casos, com a fibra amiloide patogênica (DASARI et al., 2011; FERNÁNDEZ-TRESGUERRES et al., 2010; SABATE; DE GROOT; VENTURA, 2010). A proteína de fungo Het-s, foi a primeira proteína priônica identificada por apresentar propriedades amiloides dentro dos IBs formados em bactéria, a caracterização amiloide foi realizada através de medidas de RMN (WASMER et al., 2009), e, interessantemente, quando esses agregados eram transfectados em fungos livres de prion, eles eram capazes de causar infecção, promovendo a conversão priônica (SABATÉ et al., 2009). Os mesmos resultados foram vistos para outra proteína priônica de fungo, Sup35, os IBs do tipo amiloide formados por essa proteína induziram o fenótipo de prion em ensaios de transfecção, com taxa de infecção sendo capaz de ser modulada por diferentes condições ambientes durante a formação dos IBs (GARRITY et al., 2010; SABATÉ et al., 2009; YUAN, A.H., GARRITY, S.J., NAKO, E., AND HOCHSCHILD, 2014). As evidências de que a estrutura molecular do IBs pode recapitular a arquitetura de fibras amiloides, de maneira que mesmo as propriedades patogênicas de alguns amiloides, que dependem de características conformacionais altamente específicas, podem estar conservadas nesses dois agregados, nos impulsionaram a caracterizar pela primeira vez os agregados da PrP de mamífero formados em IBs de bactérias. Apesar de serem organismos bem mais simples, estudar o mecanismo de agregação de uma proteína, como a PrP, dentro de bactérias pode nos dar informações interessantes sobre as características estruturais e patogênicas dessa proteína, além de poder ser uma fonte rápida e abundante de espécies agregadas para análises de alta resolução estrutural e para estudos de transmissibilidade. Além disso, seríamos capazes de estabelecer um novo modelo rápido e barato para triagem in vivo de compostos contra a agregação da PrP.

142

8. CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS O principal objetivo deste segundo capítulo é propor e validar um modelo simples e eficiente de formação de prions in vivo, realizado dentro de bactérias, e discutir o potencial desse sistema para compreensão de patogênese da PrP. O objetivo específico é avaliar características como estabilidade, estrutura, morfologia, resistência a digestão por PK e toxicidade de estruturas agregadas da PrP inteira (rPrP23-231) e do seu domínio C-terminal (rPrP90-231) produzidas dentro de bactérias (Escherichia coli) na forma de corpos de inclusão.

143

9. CAPITÚLO 2 – PUBLICAÇÕES

A seção de ‘Material e Métodos’, assim como, a seção de ‘Resultados e Discussão’ do segundo capítulo desta tese será apresentado no formato de artigos publicados em periódicos indexados de circulação internacional, com um artigo completo publicado na revista Microbial Cell Factories (ARTIGO 1) (MACEDO et al., 2015) e um artigo de discussão (extra-view) (ARTIGO 2), elaborado após um convite formal da editora da revista Prion, aonde escrevemos uma visão complementar sobre a importância dos nossos achados e as perspectivas geradas para os estudos futuros (MACEDO; CORDEIRO; VENTURA, 2016). Ambas as revistas autorizam online a inserção do artigo pelo autor em sua tese completa de doutorado. Esses trabalhos foram realizados durante o período do meu doutorado sanduíche na Universidade Autônoma de Barcelona no laboratório de Enovelamento de proteínas e doenças conformacionais, sob a supervisão do Prof. Salvador Ventura.

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Macedo et al. Microb Cell Fact (2015) 14:174 DOI 10.1186/s12934-015-0361-y

Open Access

RESEARCH

Mammalian prion protein (PrP) forms conformationally different amyloid intracellular aggregates in bacteria Bruno Macedo1,2,3, Ricardo Sant’Anna2, Susanna Navarro2,4, Yraima Cordeiro1* and Salvador Ventura2,4*

Abstract  Background:  An increasing number of proteins are being shown to assemble into amyloid structures that lead to pathological states. Among them, mammalian prions outstand due to their ability to transmit the pathogenic conformation, becoming thus infectious. The structural conversion of the cellular prion protein (PrPC), into its misfolded pathogenic form (PrPSc) is the central event of prion-driven pathologies. The study of the structural properties of intracellular amyloid aggregates in general and of prion-like ones in particular is a challenging task. In this context, the evidence that the inclusion bodies formed by amyloid proteins in bacteria display amyloid-like structural and functional properties make them a privileged system to model intracellular amyloid aggregation. Results:  Here we provide the first demonstration that recombinant murine PrP and its C-terminal domain (90–231) attain amyloid conformations inside bacteria. Moreover, the inclusions formed by these two PrP proteins display conformational diversity, since they differ in fibril morphology, binding affinity to amyloid dyes, stability, resistance to proteinase K digestion and neurotoxicity. Conclusions:  Overall, our results suggest that modelling PrP amyloid formation in microbial cell factories might open an avenue for a better understanding of the structural features modulating the pathogenic impact of this intriguing protein. Keywords:  Mammalian prions, Protein aggregation, Protein conformation, Inclusion bodies, Amyloids, E. coli Background Protein aggregation is the hallmark of many neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s (AD), Parkinson’s (PD), and the Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) [1], also termed prion diseases. The misfolding of a particular protein, i.e., the β-amyloid peptide (Aβ) for AD, α-synuclein (α-syn) for PD, and prion protein (PrP) for TSEs can lead to its abnormal accumulation in tissues, which usually comes along with severe cellular damages. Irrespectively of the misfolded protein sequence and structure, protein aggregation usually *Correspondence: [email protected]; [email protected] 1 Faculdade de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Carlos Chagas Filho 373, Bloco B, Subsolo, Sala 17, Rio de Janeiro, RJ 21941‑902, Brazil 4 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Spain Full list of author information is available at the end of the article

proceeds in a well-organized fashion to form amyloids in these diseases [1]. Amyloid fibrils architecture is characterized by a β-sheet enriched core, which usually binds to Congo red (CR) and thioflavin-T (Th-T) dyes [2]. TSEs form a group of lethal neurodegenerative disorders, which affect both humans and other mammals [3]. They may manifest as infectious, genetic or sporadic diseases. The structural conversion of the cellular prion protein (PrPC), into its misfolded pathogenic form (PrPSc) is the central event of these pathologies. PrPC, which is found anchored to the extracellular membrane of several cell types, has a well-defined structure, with a highly flexible and unstructured N-terminal tail and a globular C-terminal domain composed by three α-helices and two short antiparallel β-strands [4, 5] (Fig. 1). Unlike PrPC, PrPSc is an insoluble protein, mainly composed by β-sheet structures, partially resistant to proteolysis, with a high propensity to

© 2015 Macedo et al. This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http://creativecommons.org/ publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.

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Fig. 1  Mouse PrP structure and domain organization. a Three dimensional structure of the globular domain of mouse PrP (only residues 124–226 are assigned by NMR), PDB: 1AG2. Alpha helices 1, 2 and 3 are represented in red; beta strands 1 and 2 in yellow; loops and turns in green. The dotted gray line represents the unstructured N-terminal domain, comprising residues 23–120 (figure done with PyMol and disordered domain drawn with Inkscape). b Scheme of the primary structure of mature murine PrP (residues 23–231). HD hydrophobic domain; β-sheets are depicted in yellow, α-helices in red, and the remaining of the C-terminal domain in green; N-181 and N-197 are sites of glycosylation; GPI glycosylphosphatidylinositol anchor; PK proteinase K cleavage site

form both amorphous and amyloid-like aggregates [3, 6, 7]. Deposition of aggregated PrPSc in tissues is attributed to cause neurodegeneration. PrPSc aggregation becomes self-perpetuating in  vivo through the conversion of host PrPC into abnormal PrPSc, in a process catalyzed by the infectious form [6, 7]. In vitro, the assembly of prions into amyloids displays a typical nucleation-elongation reaction, but in the presence of preformed fibrillar seeds the ‘lagphase’, corresponding to the nucleation reaction, is abrogated. The reduction in the lag-phase evidences the ability of the seed to catalyze amyloid polymerization [7–9], a property that underlies the mechanism of prion conformational replication [10]. It is assumed that the PrP can adopt multiple misfolded conformations that are the molecular origin of prion strains and dictate the efficiency of the species barrier in the transmission of prions [11]. Distinct prion strains can lead to phenotypically different prion diseases in animals, with different incubation times and brain deposition profiles [12–14]. Inclusion bodies (IBs) formation in bacteria has long been regarded as an unspecific process resulting from the collapse of hydrophobic contacts between partially or totally unfolded species after protein synthesis at the ribosome [15]. However, an increasing body of evidence indicates that the bacterial IBs formed by amyloidogenic proteins share a number of common structural features with the highly ordered and, in many cases, pathogenic amyloid fibrils [16–19]. Interestingly, it was shown that a specific

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domain of a bacterial DNA replication protein, the RepAWH1, assembles into fibrils and, when expressed in E. coli, can lead to a peculiar amyloidosis through the inhibition of bacterial proliferation [19]. These RepA-WH1 aggregated particles can be vertically transmitted across generations, thus this protein was characterized as a synthetic bacterial prionoid [19]. Therefore, bacteria have become a simple model system to study intracellular protein aggregation under biologically relevant conditions that cannot be easily recapitulated in  vitro, such as the presence of chaperones and proteases, molecular crowding, and the continuous synthesis of the protein in the ribosome [20–22]. Het-s, from the fungus Podospora anserina, was the first prion protein whose bacterial IBs were shown to display amyloid-like properties [23, 24]. The differential trait of these aggregates emerged when they were transfected into prion-free fungal strains, as they promoted prionic conversion [23]. This result was later corroborated for the yeast prion Sup35 [25, 26]. The amyloid-like IBs of Sup35 induced the prion phenotype in prion-free yeast strains, the infectivity rate being modulated by the environmental conditions during the formation of IBs [25–27]. These observations provide perhaps the best evidence that the IBs molecular structure can recapitulate the architecture of amyloid fibrils, in such a way that even the infectious properties of amyloids, which depend on specific conformational features, seem to be conserved in the two type of aggregates. It was previously shown that bacterially expressed recombinant murine PrP can be turned infectious in vitro causing prion pathology when inoculated in mice [28]. Here, we address whether, like their fungal counterparts, mammalian PrP can form amyloid intracellular aggregates when expressed in bacteria. With this aim, we produced, purified and conformationally characterized the intracellular aggregates formed by the wild-type murine PrP encompassing residues 23–231 (PrPWT) and the C-terminal domain of murine PrP (PrP90–231) (Fig. 1). Our current study provides the first demonstration that recombinant murine PrPs can form amyloid structures inside bacterial IBs. Besides, although possessing similar secondary structure, PrPWT IBs and PrP90–231 IBs exhibit conformational diversity, as they bind CR and Th-T dyes to different extents, display distinct morphology, different stability and resistance against proteinase K proteolysis. These conformational differences result in different toxicity of the two PrP IBs resistant cores when added to neuroblastoma cells in culture.

Results and discussion

Aggregation of PrPWT and PrP90–231 into IBs in bacteria

The inherent aggregation propensity of amyloid proteins often results in their aggregation into insoluble

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IBs when they are produced in bacteria [29]. In several cases, these intracellular aggregates have been shown to display amyloid-like properties. To verify if this is the case for mammalian prion proteins, we expressed the murine wild-type prion protein (PrPWT) encompassing residues 23-231 (PrPWT) and the C-terminal domain of murine PrP (PrP90–231) in bacteria and purified the resulting IBs. Both PrP forms [either the fulllength, mature PrP (PrPWT) or the truncated fragment 90–231] can exist in  vivo in healthy and diseased brain and have been extensively studied [30–32]. The N-terminal unstructured domain is proposed to participate in PrP physiological function because of its ability to bind to different classes of partners, including copper ions (Cu2+), glycosaminoglycans (GAGs), nucleic acids (NAs) and lipids [33–38]. It is proposed that PrPC acts as cell surface scaffold protein, gathering different partners in a macromolecular assembly to participate in cell signalling [39]. PrPC undergoes endoproteolytic attack within its N-terminal domain, leading to the appearance of C-terminal fragments attached to the plasma membrane and soluble N-terminal peptides [30]. Both in normal and pathological brains one of these cleavages occurs at position 90, thereby generating PrP90–231 C-terminal fragment. The truncated PrP encompassing residues 90–231 corresponds to the proteinase K-resistant core of the pathogenic PrPSc, referred also as PrPRes [30]. Although the N-terminal domain appears to be unnecessary for prion propagation, since the fragment PrPRes is capable of transmitting prion disease in vivo [40]; this region may affect the pathways of prion misfolding and substantially impact PrPSc conformational diversity. Furthermore, in vivo studies have shown that mice expressing N-terminally truncated PrP develop disease more slowly and are less susceptible to infection than mice expressing PrPWT [41]. PrP forms were expressed essentially as insoluble proteins in bacteria, with only a small portion of the protein residing in the soluble fraction. Accordingly, IBs were purified from the insoluble cellular fraction (Fig. 2). PrPs were the major component in purified IBs, with PrPWT displaying a molecular weight of ~25 kDa and the PrP90–231 between 15 and 20 kDa, according to respective bands in SDS-PAGE (Fig.  2). The approximate molecular weights obtained from the electrophoresis gel are in accordance with the theoretical molecular masses for both PrPWT and PrP90−231 (23 and 16 kDa, respectively), with the addition of the histidine-tag (+~3  kDa) (see “Methods”). Further refolding, purification and cleavage steps allowed extraction of soluble and pure PrP from the IBs (see “Methods”) for subsequent in vitro fibril formation and seeding analysis.

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Fig. 2  Isolation of PrPWT and PrP90−231 IBs from E. coli cells. SDS-PAGE analysis of purified PrPs IBs. The band at ~16 kDa corresponds to the C-terminal region of PrP (PrP90−231) and that at ~25 kDa to the PrPWT (rPrP23−231), both with the histidine-tag. The purification of both PrP monomers from their respective isolated IBs is also shown, as well as the remaining soluble proteins present in the supernatant after cell fractionation (SN). Molecular weight markers are shown on the left (MW)

PrPWT and PrP90–231 form β‑sheet enriched IBs

The aggregation of proteins into amyloid fibrils results in the formation of intermolecular β-sheets [16, 42]. Attenuated Total Reflectance–Fourier Transform Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) permits addressing the structural characteristics of protein aggregates [43–46]. To get insights into the secondary structure content of the two purified PrP IBs, we analysed the amide I region of the FTIR spectrum (1700–1600  cm−1) (Fig.  3). This region corresponds to the absorption of the carbonyl peptide bond group of the protein main chain and is a sensitive marker of the protein secondary structure [47]. Deconvolution of the ATR-FTIR-absorbance spectra of PrPWT and PrP90–231 IBs allows us to assign the individual secondary structure elements and their relative contribution to the main absorbance signal (Fig. 3; Table 1). In contrast to soluble purified PrPs, which exhibit a predominant α-helical secondary structure content (Additional file 1), as previously assessed by FTIR and circular dichroism [36, 48, 49], it is evident that the truncated form (PrP90–231) has a higher contribution of β-sheets (Fig. 3; Table 1). The low frequency peak at ~1620 cm−1 together with the low intensity, high frequency band at ~1690 cm−1 (band 1, Fig. 3a, b) are attributed to antiparallel beta-sheets found in fibrils [46]. In addition, the peak at 1634–1638  cm−1 (band 4, Fig.  3a, b) found in both IBs is assigned to parallel β-sheets, indicating a

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section with OMNIC™ software. Band frequencies deviation: ±4 cm−1. The depicted wavenumbers refer to bands 1–5 (from the higher to the lower frequency) obtained from Fig. 3. Stability of PrPs IBs towards chemical denaturation

The presence of regular β-sheet secondary structure inside PrPs amyloid-like IBs implies the existence of cooperative interactions between the polypeptide chains embedded in these aggregates. To confirm this  assumption, we used chemical denaturation with urea. We have shown before that this approach allows approximating the conformational stability of bacterial intracellular aggregates [53]. IBs solubilization was measured by monitoring the changes in absorbance at 350  nm in urea concentrations ranging from 0 to 8  M. The cooperative denaturation transitions observed for both PrPs IBs support the presence of selective contacts inside these aggregates (Fig.  4). We calculated [urea]1/2 for IBs solubilization to be 3.72  ±  0.10 and 2.61  ±  0.20  M, for PrPWT and PrP90–231IBs, respectively; exhibiting thus significantly different conformational stability. The stability of these in vivo formed PrP aggregates is, however, lower than the one reported for in  vitro formed PrPWT fibrils, with m1/2  ~  4.5  M in guanidine hydrochloride-induced denaturation experiments [54]. This is not surprising if we take into account that ordered and disordered conformations appear to coexist in IBs and that the presence of minor concentrations of other proteins might also condition the stability of these in vivo formed aggregates. Fig. 3  Secondary structure analysis of PrPs IBs by ATR-FTIR. The secondary structure content of PrPWT (a) and PrP90−231 (b) inside the IBs was determined following ATR-FTIR absorbance of dry samples in the amide I region of the infrared spectrum (solid black line). Spectral components in the Fourier deconvoluted FTIR spectra (dashed gray line) are shown as solid gray lines (bands 1–5). The area and position of the correspondent bands are indicated in Table 1

mixed β-sheet composition for PrPs found in inclusion bodies. In general, the observed absorption FTIR spectra is similar to the one shown for prion rods extracted from scrapie-infected hamster brains [50]. As also seen for infectious prion rods [50], part of the native structure was maintained for both extracted IBs (peaks at ~1655 cm−1 attributed to α-helical/disordered structure). Thus, we suggest that a fraction of the molecules are adopting the intrinsic native helical fold, since native protein structure has been described to be retained in the IBs formed by certain proteins, such as GFP and others [51, 52]. Amide I ATR-FTIR spectra deconvolution and band assignment was done as described in the Methods

PrPWT and PrP90–231 IBs bind to thioflavin‑S in living cells

We have shown recently that thioflavin-S (Th-S) staining of living bacterial cells can be used to detect the presence of intracellular amyloid-like structures as well as to find inhibitors that interfere with amyloid formation [55, 56]. The staining of cells expressing PrPWT and PrP90–231 was monitored using fluorescence microscopy. As it can be observed in Fig.  5, induced cells exhibited a green fluorescent background with fluorescent foci located at the cell poles, suggesting that these proteins adopt amyloidlike conformation in bacterial IBs. In contrast, induced cells containing an empty plasmid exhibited only residual fluorescence. Amyloid properties of PrPWT and PrP90–231 IBs

We evaluated the binding of purified PrP IBs to the amyloid diagnostic dyes CR and Th-T to confirm that the prevalent β-sheet in these aggregates has an amyloid-like nature and to further explore if the IBs would present different amyloid properties. To evaluate the specific contribution of PrP IBs in these assays, relative to that of other proteins possibly present in this fraction,

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Table 1  Assignment of secondary structure components of purified E. coli PrPWT and PrP90−231 IBs in the amide I region of ATR-FTIR spectra PrPWT IBs Band (cm−1)

PrP90−231 IBs Area (%)

Secondary structure

Band (cm−1)

Area (%)

Secondary structure

1621

16

β-Sheet

1623

23

β-Sheet

1634

25

β-Sheet

1638

20

β-Sheet

1655

40

Unordered/α-helix

1656

39

Unordered/α-helix

1677

15

β-Sheet/turns

1678

14

β-Sheet/turns

1692

4

β-Sheet

1693

Fig. 4  PrPs IBs present different stability against urea treatment. Solubilization of PrPs IBs (OD350 = 1.0) at equilibrium in the presence of increasing concentrations of urea, monitored by light scattering at 350 nm at room temperature. Values shown are the mean ± SD

cells bearing the same plasmid without any insert were induced and the insoluble fraction purified in the same manner than those containing the PrP cDNAs and used as negative control.

4.5

β-Sheet

The absorbance of CR increases and the spectrum maximum red-shifts in the presence of amyloid-like structures [15]. We calculated the amount of CR bound in relation to the negative control (see “Methods”). We observed a ~tenfold increase for PrPWT IBs and sevenfold increase for PrP90–231 IBs in relation to the control insoluble fraction (Fig. 6a). ThT fluorescence emission increases significantly when the dye binds to amyloid fibrils [57]. Both PrPs IBs promote a strong increase in Th-T fluorescence (Fig.  6b). In agreement with CR data, PrPWT IBs promote a larger increase in Th-T fluorescence (eightfold) than the promoted by PrP90–231 IBs (3.5-fold), whereas the negative control did not induce any significant increase in fluorescence emission relative to free Th-T (Fig.  6b). Although these two PrP IBs possesses similar secondary structure content, these data indicate that murine PrPWT and PrP90–231 adopt amyloid-like structures when they aggregate intracellularly in bacteria, displaying, however, different fibrillar structures. Indeed, it is known that mature fibrils of different PrP species, like hamster or mice, have similar secondary structures but show variation in fibrillar morphology [58].

Fig. 5  Th-S staining in intact bacterial cells expressing PrPs. Bacteria expressing recombinant PrPs (b PrPWT; c PrP90–231) or containing an empty plasmid (control) (a) were stained with Th-S and observed at ×40 magnification by fluorescence microscopy to visualize the green fluorescence characteristic of amyloid intracellular structures. Arrows indicate the position of IBs

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Fig. 6  Specific binding of amyloid dyes to PrPs IBs. a CR binding assay in the presence of PrPs IBs and control insoluble fraction (OD350 = 1.0); the extent of binding is calculated as described in “Methods”. b Fluorescence emission spectrum of Th-T in the presence of PrPs IBs and control insoluble fraction (OD350 = 0.1). Samples were excited at 445 nm and emission was collected from 480 to 580 nm. Both assays were done in PBS

Amyloid morphology of PrPs IBs

Transmission electron microscopy (TEM) was used to investigate the morphology of PrPWT IBs and PrP90–231 IBs. Interestingly enough, we were able to observe amyloid fibrils in PrPWT IBs, without any previous treatment with proteases or sonication, coexisting with less ordered aggregates (Fig. 7a, b). For the C-terminal PrP IBs (PrP90– 231 ) we found uniformly shaped aggregates, likely corresponding to prefibrillar structures, similar to aggregates populated upon nucleic acid-induced PrPWT aggregation (Fig. 7c, d) [36]. The different morphology of both aggregates fits well with their different stability and binding to amyloid dyes. The amyloid fibrils detected in PrPWT IBs show lateral association and display a ribbon-like assembly composed of two or more aligned non-twisted flat filaments (Fig. 7b). These structural features resemble those of in  vitro-formed amyloid fibrils by purified recombinant PrPs (see Fig.  8). In addition, we found also single filaments (Fig. 7a, b). This fibrillar disposition is normally found in in  vitro-formed PrP amyloids [59]. The fibrils found in PrPWT IBs possess variable widths and may

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show some curvature, a feature of ribbon-like assemblies. Some ribbons were observed splitting apart either at their edges or at the middle, evidencing that they were still formed by individual protofibrils (Fig. 7b). We could also observe that some ribbons are associated with each other and form fibrils with a dichotomous pattern, a characteristic well described by Makarava et  al. in 2006 for mouse PrP amyloid fibrils formed in  vitro [58] (see Figs. 7a, b, 8, 9). This morphology was seen mostly during the nucleation phase of the fibril polymerization and was difficult to find during the subsequent elongation phase. Therefore, we conclude that this morphology represents a stage of early lateral association rather than dissociation of preformed fibrils into protofilaments [58]. In this same work, Makarava et  al. showed well distinguishable subsets of fibrils formed by the hamster PrP under identic solvent conditions. It thus suggests that the murine PrP aggregates freely formed inside bacteria in our work can reproduce the same aggregation pathway in vitro without the need of a specific condition, such as buffer, pH, temperature and agitation. This polymorphism within fibrils has been attributed to the variable number of constitutive protofilaments and distinct modes of their lateral association within mature fibrils [58, 60]. In fact, scrapie fibrils derived from animals with prions diseases were also found to display high levels of polymorphism [11, 61, 62]. Thus, PrPWT IBs constitute a bacterial reservoir of different PrP amyloid structures that coexist with more disordered aggregates all formed by the same sequence, exemplifying thus conformational diversity. The striking different morphology of PrP90–231 IBs and PrPWT strongly suggests that the N-terminal PrP is a major contributor to the formation of the detected intracellular ordered amyloid-like assemblies. Amyloid seeding capacity of PrPWT IBs

The kinetics of amyloid fibril formation usually follows a sigmoidal curve that reflects a nucleation-dependent growth mechanism [63]. As expected, the in  vitro conversion of purified PrPWT into fibrils follows this kinetic scheme (Fig.  8), with a lag phase of ~7  h, which corresponds to the formation of the initial nuclei and that is followed by polymerization or fibril growth, as confirmed by TEM imaging of the solution during the aggregation reaction (Fig.  8). Seeded protein aggregation is a well-established mechanism for in  vivo amyloid fibril formation and underlies prion propagation [64, 65]. Accordingly, in the presence of 2  % preformed fibrils, the lag phase of the reaction is shortened to ~3.5  h. To test if the detected amyloid-like structures in PrPWT IBs were able to template the conversion of its respective soluble species into amyloid fibrils, we performed the aggregation reaction in the presence of limited amounts

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Fig. 7  Morphological analysis of PrPs inside IBs. Fresh and intact PrPWT (a, b) and PrP90–231 (c, d) IBs observed by negative staining and transmission electron microscopy display amyloid-like structures. Scale bars 0.5 μm (a), 0.2 μm (b), 0.2 μm (c, d). The arrows indicate single filaments; the asterisks mean unzipped filaments and the hash indicates the initial step of a protofibril formation

of preformed purified PrPWT IBs (Fig.  10). Interestingly enough, the effect exerted by IBs on fibril formation kinetics is similar to that promoted by the corresponding PrPWT amyloid fibrils seeds, reducing the lag phase of the reaction to ~2  h. However, in PrPWT IBs seeded reactions large aggregates that cannot be maintained in solution appear to accumulate after 12  h (720 min) of polymerization (Fig.  10). In contrast to amorphous aggregation, amyloid formation is a specific process that can only be seeded by sequentially and structurally homologous fibrils [66]. To evaluate if such selectivity also applies in the case of PrP IBs, we performed crossseeding experiments, seeding the aggregation reaction

of initially soluble PrPWT with preformed and purified PrP90–231 IBs. Importantly, the presence of PrP90–231 IBs does not have any noticeable impact on the nucleation reaction, the overall kinetics resembling those of a nonseeded reaction (Fig. 10), thus confirming that a specific molecular recognition between soluble and fibrillar states is a requirement for seeding and that in the case of PrPWT the N-terminal tail might play a crucial role in this process. Accordingly, it has been previously observed by high-pressure FTIR that the N-terminal domain modulates PrP misfolding and aggregation [67]. We analysed the morphology of the aggregates present in the final reaction of seeded and unseeded kinetics by

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Fig. 8  Evolution of PrPWT aggregates morphology during in vitro aggregation. After purification and refolding PrPWT was converted into amyloid fibrils as described in “Methods”. The aggregates morphology was assessed at different times by negative staining and transmission electron microscopy. Scale bars 0.2 μm (10 h), 0.5 μm (24 h), and 0.5 μm (72 h)

TEM. In agreement with spectroscopic data, the presence of PrPWT IBs and fibrils at the beginning of the reaction resulted in an increased number of amyloid fibrils in respect to non-seeded reactions or reactions seeded with PrP90–231 IBs. However, the acceleration of the fibrillation promoted by PrPWT fibrils and especially by PrPWT IBs results in the formation of apparently amorphous material tightly associated to the newly formed amyloid fibrils (Fig. 9). Interestingly, we could see after seeding PrP amyloid formation with PrPWT IBs the presence of twisted fibrils (Fig.  9). Several early prion studies reported that filamentous structures were found in scrapie-infected rodent brain [68, 69]. In 1981, one report has called attention to helical fibrils formed by the twisting of two or four filamentous structures; they were found in preparations from brains of scrapie-infected rodents [70]. The ultrastructural morphology of these fibrils was reported to be different from that of many amyloids [71]. Nowadays, there are many reports providing information about the PrP twisted fibrillar structures [60]. Using small amounts of the PrPWT IBs seeded solution for re-seeding PrPWT soluble protein results in formation of visible fibrillar material that, when analysed by TEM, displays typical amyloid morphology coexisting with more amorphous material, confirming thus the striking ability of PrPWT IBs to effectively propagate soluble protein conformational conversion into amyloid structures (Additional file 2). PrPs IBs display a proteinase K resistant core

Proteinase K (PK) is a protease normally used to map the protected core of amyloid fibrils. Despite its high activity for cleaving peptide bonds, PK cannot attack the highly packed backbones in an amyloid β-sheet structure. In contrast to soluble forms of PrPs, which are PK-sensitive,

aggregated forms of PrP are known to have a PK-resistance profile that can be dependent on the in vitro aggregation conditions or even on the different in vivo sources from where they were extracted (such as diseased brains) [49, 72–75]. To verify the PK-resistance of the two different PrP aggregated deposits formed inside the cell, we evaluated the PK digestion of PrP IBs by tricine SDSPAGE (Fig.  11). There were differences in the PK-digestion pattern between the two PrP IBs. Upon incubation of PrPWT IBs with PK, the resistant fibrillar core is visualized as a major band with 16  kDa, which corresponds to the PrP C-terminal domain as evidenced by western blot analyses with the anti-PrP antibody R20 that recognizes a C-terminal epitope in PrP (residues 218–232) [76] (Additional file 3). This fragment possesses the same apparent molecular weight of the C-terminal domain (residues 90–231) (16 kDa), indicating that the N-terminal domain was cleaved and the rest of the protein was in a protected conformation. Most of the resultant fragments of PK-digested PrPWT IBs, which vary from ~15 to 6  kDa were labeled by R20, and even after 60  min of reaction the larger fragment (16 kDa) persists (Fig. 11a). Indeed, the PK-resistant core of the pathogenic PrPSc corresponds also to the PrP C-terminal domain [14]. The PK resistance of PrPWT IBs is comparable with the PK-resistant form of PrPSc. In PrP amyloid IBs we studied here, the 16  kDa band resisted PK treatment under conditions that are commonly used for PK reactions with the scrapie brain homogenates (incubation for 1 h at neutral pH) [77, 78]. In addition, this same resistant fragment (16 kDa) is also observed upon PK-digestion of the in vitro-formed PrP amyloid fibrils [79]. In contrast, PKdigestion of PrP90–231 IBs showed a different profile; after 30  min of PK-treatment the apparent 16  kDa fragment was completely degraded, and the remaining resistant

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Fig. 9  Morphology of PrPWT aggregates at the end of the aggregation kinetics. Aggregates were collected at the end (~19 h) of non-seeded (a), seeded (c–f) and cross-seeded (b) reactions (Fig. 10) and they were monitored by negative staining and transmission electron microscopy. Scale bars 2 μm (a); 0.5 μm (b); 1.0 μm (c); 0.2 μm (d); 2 μm (e); 1 μm (f)

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Fig. 10  Aggregation kinetics of PrPWT. The aggregation reactions of 0.5 mg/mL of purified and refolded rPrPWT were carried out under constant agitation at 600 RPM and 37 °C. In vitro preformed fibrils (2 %) or PrPs IBs (final OD350 = 0.1) were used for seeding and crossseeding assays. PrP fibrilization (black line) as a function of time, exhibits a typical nucleation-elongation profile. The lag phase is reduced in the presence of pre-aggregated homologous protein, either PrPWT fibrils (blue line) or PrPWT IBs (red line). Cross-seeding with PrP90–231 IBs (green line) did not affect the fibrilization extent and kinetics

fragments have lower molecular mass (Fig.  11b). These PrP IBs do not possess the same conformation and, thus, as expected, differ in their biochemical and biophysical properties. Recently, it was shown that full-length recombinant PrP (23–231) can aggregate into a β-sheet-rich oligomeric species (~12 PrP molecules), and that the protein N-terminal region (23–90) was necessary for the formation of this oligomer [80]. At the same condition, PrP lacking part of the N-terminal region (PrP91-231) aggregated into heterogeneous species [80]. It is increasingly recognized the essential role of the N-terminal  domain in directing PrP intermolecular association and in promoting the stability and proper folding of the C-terminal domain [80–82]. Taken together, this result is in good agreement with the lower stability we have shown to extracted PrP90–231 IBs relative to PrPWT IBs (Fig. 4). To confirm the conformational diversity exhibited by PrP90–231 and PrPWT we explored whether their differently protected amyloid cores display different cytotoxic properties. To this aim PrP IBs where digested with PK for 60  min, the protease was inactivated and the digested aggregates were administered to neuroblastoma SH-SY5Y cells. The combination of SYBR green and propidium iodide (PI) staining allows assessing the cell viability by confocal fluorescence microscopy, as viable cells are permeable to SYBR green and PI only enters cells with permeabilized membranes corresponding to dead cells. The impact of aggregates

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in cell morphology was also monitored (Fig.  12). Cells treated with inactivated PK were used as negative controls. Cells treated with the PK-resistant PrP90–231 core exhibited normal morphology and were not stained with PI, indicating that it does not exert significant toxicity. In contrast, the PK-resistant PrPWT core was neurotoxic, since its presence resulted in cell death  (cells were stained with PI) and in abnormal cell morphology. Although the prion infectious region is attributed to the resistant 90–231 core (PrP27-30 in  vivo), we did not see neurotoxic activity for PK-digested PrP90–231 IBs, only for digested PrPWT IBs. We showed here that the protease-resistant region of the PrPWT IBs, after 60 min of reaction, belongs to the C-terminal domain in contrast to PrP90–231  IBs digestion,  which renders smaller fragments that do not bind to PrP antibody (R20) (Additional File 3).  One might speculate that the largest fragment of the C-terminal resistant to PK-digestion (the 16 kDa fragment) is necessary to retain cytotoxicity; this fragment might have its intact disulphide bridge which is well known to be necessary to cause prion diseases [83]. Further experiments will be required to address which are the residues involved in the toxic conformations we have seen for these PrPWT  IBs PKresistant core. Therefore, they are not the same species, and thus, are expected to result in different cytotoxic effects. Probably, the low molecular weight fragments derived from PrP90–231 IBs are not properly folded into a toxic conformation. Moreover, the amount of PK-resistant fragments for both PrP constructs differs, as the sensitivity to PK is depends on the aggregated structure.

Conclusions Prions are misfolded, self-propagating and infectious proteins. The bacterial inclusion bodies formed by fungal prions, such as HET-s PFD, Ure2p and Sup35-NM have been shown to display an amyloid fold and to be infective. This ability to embrace potentially harmful misfolded polypeptides into insoluble deposits seems to be a strategy mechanism perpetuated along the evolution from prokaryotic bacteria to highly complex eukaryotic organisms. We showed here for the first time that the IBs formed by mammalian prion proteins are also enriched in seeding competent amyloid-like structures, supporting the formation of prion-like conformations inside bacteria. Moreover, these aggregates display conformational diversity, thus becoming an interesting and simple model to study how this property can be modulated in vivo by the quality control machinery. Since PrP accumulates in IBs at high levels and these biological particles are easily purified, it is suggested that they might become a convenient source to obtain prion particles. It is clear that the bacterial cytosol where these aggregates are formed

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Fig. 11  PK proteolysis of PrPs IBs. Tricine SDS-PAGE analysis of a PrPWT IBs and b PrP90–231 IBs after incubation with 2.5 µg/mL PK at 37 °C for the indicated times. The smaller fragments remaining after PK proteolysis indicate a resistant core of these PrP IBs. The molecular weight ladder (MW) is placed offset for clarity. The arrows indicate C-terminal PrP fragments

differs from that of eukaryotic cells; however, the potentiality of these inside-the-cell formed amyloid particles to adopt infective conformations is, in our opinion, much higher than the one of the aggregates formed by the purified recombinant protein in vitro after complete denaturation and refolding procedures. In addition, as already shown for other amyloids [15], PrP-producing bacterial cells can potentially be used for the easy and cheap screening of anti-aggregation compounds able to

prevent intracellular PrP amyloid-like aggregation, being thus useful in the early stages of discovery of anti-prionic drugs.

Methods Prion proteins expression and purification

E. coli C43 (DE3) cells were transformed with plasmids (pET-28 b) encoding the murine wild-type prion protein (PrPWT) encompassing residues 23–231 and the murine

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and allowed to grow to an OD600  =  0.7. At OD600  =  0.7, expression was induced with 1  mM isopropyl-1-thio-βd-galactopyranoside (IPTG). Cells were harvested after overnight induction (18–20  h), centrifuged, resuspended in 60 mL of buffer U (8 M urea, 10 mM Tris–HCl, 100 mM NaH2PO4, 10  mM reduced glutathione, pH 8.0). After sonication and centrifugation, the soluble protein fraction was added to 5 mL of HisTrap FF prepacked column (GE Healthcare) and washed with 30 mL of buffer U. On-column oxidative refolding was performed by applying for 2 h a 160  mL-gradient of buffer U to buffer B (10  mM Tris– HCl, 100  mM NaH2PO4, pH 8.0). Then, the column was washed with 50  mL buffer B. Unspecific bound proteins were removed from the column with 50 mL of 50 mM imidazole in buffer B. The recombinant proteins PrPWT and PrP90–231 were eluted with buffer E (10 mM Tris, 100 mM NaH2PO4, 750 mM imidazole, pH 5.8). Histidine tail-fused PrP was dialyzed against milliQ water at least two times. The histidine tail was removed from the prion protein using thrombin (1:1000). The cleavage reaction was carried out at room temperature for 2 h. After thrombin cleavage, the sample was repurified in the HisTrap column. Finally, the protein solution was dialyzed against milliQ water two times to remove any remaining salt. 15 % SDS-PAGE analysis revealed more than 95 % of purity. PrPWT and PrP90–231 IBs extraction

Fig. 12  Cytotoxicity of the PK-resistant core of PrP IBs visualized by confocal microscopy. Confocal fluorescence microscopy images of SH-SY5Y cells stained with SYBR green or propidium iodide (PI). Cells were treated with PK-derived fragments of PrPWT IBs (panels c–j), or PrP90−231 IBs (k, l). All samples were incubated with PK for 1 h at 37 °C and PK was inactivated before applying to cells. Inactivated PK in PBS was used as control (a, b). Representative images of two independent experiments done in duplicate are shown. Further details are described in the “Methods”

PrP C-terminal domain residues 90–231 (PrP90–231), both containing a histidine-tag. Cells were grown aerobically in liquid Luria–Bertani (LB) medium containing appropriate antibiotics in a rotary shaker at 37  °C and 250 RPM. Overnight cultures were diluted 100-fold in LB

IBs were purified from IPTG-induced cells harbouring the pET-28(b)/PrPWT plasmid, the pET-28(b)/PrP90–231 plasmid and vector alone by detergent-based procedures. IBs were purified from induced cell extracts by detergentbased procedures as previously described [17]. Briefly, cells in a 10 mL culture were harvested by centrifugation at 12,000g (at 4 °C) for 15 min and resuspended in 200 µL of lysis buffer (50  mM Tris–HCl pH 8.0, 1  mM EDTA, 100  mM NaCl), plus 30  µL of 100  mM protease inhibitor PMSF and 6 µL of a 10  mg/mL lysozyme solution. After 30  min of incubation at 37  °C under gentle agitation, Nonidet-P40 was added at 1  % (v/v) and the mixture was incubated at 4 °C for 30 min. Then, DNase I and RNase were added to a final concentration of 25  μg/mL and 3  µL of 1  M MgSO4 was added. The resulting mixture was further incubated at 37  °C for 30  min. Protein aggregates were separated by centrifugation at 12,000g at 4  °C for 15  min. Finally, IBs were washed once with the same buffer containing 0.5 % Triton X-100 and once with phosphate buffered saline (PBS). After a final centrifugation at 12,000g for 15 min, pellets were stored at −20 °C until analysis. The frozen pellets were reconstituted in PBS. SDS-PAGE analysis revealed that in all cases the murine prion proteins were the major polypeptidic components of the aggregates. Prion proteins concentration in IBs was estimated using image densitometry software

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ImageJ in the SDS-PAGE gel analysis in comparison with the respective dosed purified protein. We performed the same procedures with cells extracts of bacteria containing an empty plasmid as control IBs. Secondary structure determination

Attenuated total reflectance (ATR)-Fourier Transformed Infrared spectroscopy analyses of PrPWT and PrP90–231 IBs were performed using a Nicolet 6700 IR spectrometer (Thermo Scientific, USA) equipped with an ATR accessory. Dried samples were applied directly to the ATR crystal to be analysed. Each spectrum consisted of 128 accumulated scans, measured at a spectral resolution of 4 cm−1 within the mid-IR range (4000–675 cm−1). Fourier deconvolution of the FTIR spectra was performed with a resolution enhancement factor of 1.6 and a bandwidth of 21  cm−1. Peak position and curve fitting were determined with OMNIC™ software v. 8.0 (Thermo Scientific WI, USA) with a mixed GaussianLorenztian function, allowing assignment of different secondary structure components in the amide I range (1700–1600 cm−1) [47, 48, 67]. Congo red binding

To get insights into the amyloid nature of the PrPWT and PrP90–231 IBs, CR binding assays were performed. The interaction of 20 μM CR with the purified IBs (final OD600: 0.1) was tested using a Cary100 UV/Vis spectrophotometer (Varian, Palo Alto, CA, USA). CR binding was quantified by the equation: CR bound = Abs540nm/25, 295 − ABS477nm/46,306 [84]. The extent of amyloid structure was measured by the increase of CR bound to PrP IBs in relation to control IBs [IBs purified from IPTGinduced cells harbouring only the pET-28(b) plasmid].

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buffer and diluted at an OD600 of 0.1. Th-S was added at 125  µM final concentration; cells were then incubated for 1 h and washed twice with PBS. Cells were placed on top of a microscope slide and covered with a cover slip. Photographs were acquired at 40-fold magnification under UV light in a Leica fluorescence microscope (Leica DMRB, Heidelberg, Germany). Chemical denaturation

For stability assays, purified PrPWT and PrP90–231 IBs were prepared at final OD350  =  1 in PBS containing selected concentrations of urea ranging from 0 to 8 M. The reactions were allowed to reach equilibrium by incubating them for 12 h at room temperature. The fraction of soluble protein (fS) was calculated from the fitted values using equation: fS = 1 − ((yS − y)/(yS − yA)), where yS and yA are the absorbance at 350  nm of the soluble and aggregated protein, respectively, and y is the absorbance of the protein solution as a function of the denaturant concentration. The value m1/2 was calculated as the denaturant concentration at which fS  =  1/2. OD350 changes were monitored with a Cary400 Varian spectrophotometer. Transmission electron microscopy (TEM)

Each sample (20 μL) was applied to a carbon coated copper grid, and after 5 min the grid was washed with MilliQ water. Samples were stained with 2 % (w/v) uranyl acetate for 1 min and then washed again. Images were collected on a Jeol 1200 microscope (Boston, MA, USA) operating at 80 kV. In vitro conversion of PrP into amyloid fibrils

Th-T binding was used to probe amyloid presence in the samples. Incubation of 30 μM Th-T with PrPWT IBs and PrP90–231 IBs (final OD600: 0.1) or the correspondent amyloid fibrils was recorded using a Jasco FP-8200 spectrofluorometer (Jasco Inc, MD, USA) with an excitation wavelength of 445  nm and emission range from 480 to 580  nm at 37  °C in PBS. Five individual scans were averaged for each measurement. The intensity of the spectra at the 482 nm maximum was recorded as an indication of the extent of amyloid conformation in the aggregates.

To target amyloid fibril formation, PrP solutions were prepared immediately before use by resuspending lyophilized purified PrPWT powder in 4 M GdnHCl, 0.02 M thiourea, and 0.1 M MES, pH 6.0, in a protocol adapted from previous studies [59]. Samples were centrifuged at 12,000g for 5  min and the protein concentration was determined by its extinction coefficient at 280  nm (63,495  M−1  cm−1), calculated from the PrPWT primary sequence in http://web.expasy.org/protparam/. The fibrillation reactions of 0.5 mg/mL PrP were carried out in 1.5-ml conical low-binding plastic tubes up to a total reaction volume of 0.6 ml at 37 °C with continuous shaking at 600  rpm for at least 3 days using an Eppendorf Thermomixer Comfort (Eppendorf, USA). Aliquots from each sample were taken over time.

Thioflavin‑S binding in living cells

Seeding assays

Detection of thioflavin-S (Th-S) binding was performed in living cells expressing PrPWT, or PrP90–231 and control non-induced cells. Bacterial cells were washed with PBS

PrP aggregation departing from monomeric recombinant PrP was monitored by measuring the transition from non-aggregated to aggregated state by following light

Thioflavin T (Th‑T) binding assay

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scattering at 350 nm in a Jasco FP-8200 spectrofluorometer (Jasco Inc, MD, USA). The polymerization reactions showed typical nucleation-elongation kinetics of amyloid formation. The reactions were carried out with 0.5  mg/ mL of soluble purified PrPWT in 4  M GdnHCl, 0.02  M thiourea, and 0.1 M MES pH 6.0 using 1 cm-path length quartz cuvette in a total reaction volume of 1 mL at 37 °C with continuous shaking at 600  rpm using micro-stir bars. In the seeding assays, a solution of PrPWT IBs resuspended in PBS with OD350 of 10.0 were sonicated for 10 min, and then diluted 100-fold (final OD350 = 0.1) at the beginning of the reaction. The seeding ability of 2 % preformed fibrils (after 10  min of sonication) was also evaluated. Cross-seeding assays were performed in the same manner by adding a sonicated solution of PrP90–231 IBs (final OD350 = 0.1) to initially soluble PrPWT. Confocal microscopy and image processing

Confocal images of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cell cultures were captured in complete medium at 37 °C, using a laser scanning confocal microscope (Leica TCS SP2 AOBS equipped with a HCX PL APO 63  ×  1.4 oil, immersion objective, Germany). Briefly, SH-SY5Y cells were seeded in 35  cm2 plates (Mat Tek) with approximately 30 % of confluence in complete medium and incubated for 72 h in the presence of sterile PBS buffer + PK (positive control) and the PK-resistant core of the PrPs IBs. Proteinase K was inactivated by boiling all solutions before applying them to cultured cells. Cells were incubated with 0.5  μg/mL SYTO green and 10  μg/mL propidium iodide (PI) (Molecular Probes) for 15  min at 37 °C and washed twice with PBS buffer. Cell morphology was analysed by confocal fluorescence microscopy using an orange diode (588–715  nm emission collected) and a UV laser (excited at 350 nm and collected at 405 nm). Two independent experiments, both in duplicate were done and the entire field of each plate was observed at the microscope. Proteinase K (PK) resistance assay

The PK concentration in this assay was optimized in preliminary experiments (not shown). PrPWT IBs and PrP90–231 IBs at final OD350 of 0.5 were incubated with PK (Sigma-Aldrich, USA) at final concentration of 2.5 μg/ mL in PBS for 1 h at 37 °C. Aliquots of PK digestion were taken at every 10 min and the reaction quenched by the addition of the same amount of 4 times concentrated denaturing sample buffer. Samples were heated at 95  °C for 5 min and analysed by Tris–Glycine SDS-PAGE. The assay with soluble purified recombinant PrP was performed in the same manner [85].

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Additional files Additional file 1. In the Supplemental Material Section the Amide I region of the ATRFTIR spectrum of purified native recombinant PrP23–231 is shown, along with the corresponding spectral bands assigned to different secondary structure components. Additional file 2. In the Supplemental Material Section results from visual and TEM observation of fibrils formed after a second consecutive round of PrPWT aggregation using PrPWT IBs as seeds are presented. Additional file 3. In the Supplemental Material Section results from western blot analyses of PrPWT IBs and PrP90–231 IBs after PK-digestion are presented.

Authors’ contributions BM carried out most of the experiments and drafted the manuscript. RS and SN participated in the experimental work. SV and YC supervised the project and revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. Author details 1  Faculdade de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Carlos Chagas Filho 373, Bloco B, Subsolo, Sala 17, Rio de Janeiro, RJ 21941‑902, Brazil. 2 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Spain. 3 CAPES Foundation, Ministry of Education of Brazil, Brasilia, DF 70040‑020, Brazil. 4 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Spain. Acknowledgements We thank Pablo Castro for help with microscopy analysis and we also thank Dr. Byron Caughey (RML, NIH) for providing us the rabbit polyclonal anti-PrP antibody R20. This work was supported by Ministry of Education of Brazil [CAPES process number: 99999.002869/2014-04 to the fellow student B.M]; and by Ministerio de Economia y Competividad, Spain [BFU2013-44763P to S.V.]; by ICREA [ICREA Academia 2009 to S.V.] and by FAPERJ, CNPq and INBEB from Brazil to Y.C. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Received: 6 July 2015 Accepted: 17 October 2015

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Prion, 10:112–118, 2016 Ó 2016 Taylor & Francis ISSN: 1933-6896 print / 1933-690X online DOI: 10.1080/19336896.2016.1141859

Mammalian prion amyloid formation in bacteria Bruno Macedoa,b, Yraima Cordeirob, and Salvador Venturaa a

Institut de Biotecnologia i de Biomedicina and Departament de Bioquimica i Biologia Molecular, Universitat Autonoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona), Spain; b Faculdade de Farmacia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

ABSTRACT. Mammalian prion proteins (PrPs) that cause transmissible spongiform encephalopathies are misfolded conformations of the host cellular PrP. The misfolded form, the scrapie PrP (PrPSc), can aggregate into amyloid fibrils that progressively accumulate in the brain, evolving to a pathological phenotype. A particular characteristic of PrPSc is to be found as different strains, related to the diversity of conformational states it can adopt. Prion strains are responsible for the multiple phenotypes observed in prion diseases, presenting different incubation times and diverse deposition profiles in the brain. PrP biochemical properties are also strain-dependent, such as different digestion pattern after proteolysis and different stability. Although they have long been studied, strain formation is still a major unsolved issue in prion biology. The recreation of strainspecific conformational features is of fundamental importance to study this unique pathogenic phenomenon. In our recent paper, we described that murine PrP, when expressed in bacteria, forms amyloid inclusion bodies that possess different strain-like characteristics, depending on the PrP construct. Here, we present an extra-view of these data and propose that bacteria might become a successful model to generate preparative amounts of prion strain-specific assemblies for highresolution structural analysis as well as for addressing the determinants of infectivity and transmissibility. KEYWORDS. amyloid, bacteria, inclusion body, prion, recombinant, strain, transmission

BACKGROUND Prions are misfolded, self-perpetuating and infectious entities derived from proteins natively expressed in the host. Once formed, prions can propagate in an auto-catalytic

manner, recruiting the normal cellular protein to fold into its abnormal conformation.1,2 Mammalian prion diseases, also termed transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), are fatal neurodegenerative disorders that affect humans and other mammals. Despite they have

Correspondence to: Yraima Cordeiro; Av Carlos Chagas Filho 373, CCS, Bloco B subsolo S17, 21941-902, Rio de Janeiro, RJ, Brazil; Email: [email protected]; Salvador Ventura; Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autonoma de Barcelona, 08193-Bellaterra (Barcelona), Spain; Email: [email protected] Received 21 December 2015; Accepted 11 January 2016. Color versions of one or more of the figures in this article can be found online at www.tandfonline.com/kprn. Extra View to: Macedo B, Sant’Anna R, Navarro S, Cordeiro Y, Ventura S. Mammalian prion protein (PrP) forms conformationally different amyloid intracellular aggregates in bacteria. Microb Cell Fact 2015; 14(1):174; http://dx.doi.org/10.1186/s12934-015-0361-y 112

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been described since the late 18th century, the recognition that these diseases were caused by infectious proteins became clear only in the early 1980-s, largely due to the work of Stanley Prusiner.3 Prusiner’s studies were fueled by the work from Tikvah Alper on the infectiousagent resistance to extreme conditions, such as ionizing radiation4; and also by the initial proposal of the protein-only hypothesis by Griffith in the mid 1960-s.5 Nowadays, a prion-like behavior is also attributed to other proteins involved in neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, besides the classical prion itself (TSEs).6 Therefore, prion pathogenesis seems to be more general than previously thought, and it will likely pass from being the exception to become the general case in protein misfolding diseases (PMDs). Despite diverging in primary sequence and structure, many misfolded proteins can aggregate into highly-ordered amyloid fibrils leading to the pathological condition called amyloidosis.7 The amyloid state of a protein can convert the cellular form of a protein with the same or very similar primary sequence into its amyloid conformation, ultimately leading to its intracellular aggregation and cell-to-cell transmission.8 The progressive accumulation of the aberrant protein in the neuronal tissue is the hallmark of the neurodegenerative PMDs. One peculiar characteristic of mammalian prion proteins (PrPs) is the formation of strains, which have been related to the multiple conformations that could be adopted by the pathogenic scrapie PrP (PrPSc).9 Prion strains are responsible for the wide spectrum of phenotypes observed for prion diseases. PrPScstrain isolates, when inoculated into hosts of their respective species, cause disease with different features, i.e. the length of incubation time, the pattern of protein deposition in the brain, and the extension of the histopathological damage.10,11 Once it became evident that the strain properties of PrPSc were encoded by the particular conformation of the aggregated state, many efforts were devoted to recreate prions in vitro, and to study their biochemical and physical characteristics, e.g. their mechanism of

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aggregation, their structure and their resistance to PK-digestion. A first advance was made when recombinant C-terminal murine prion protein (mPrP89-230) produced in Escherichia coli (E. coli) was polymerized into amyloid aggregates in vitro and then inoculated intracerebrally into transgenic mice expressing PrP89230 . The mice developed neurologic dysfunction and the prion protein in their brain extracts showed resistance to protease digestion. These brain extracts were also able to transmit the disease to other mice but with low levels of infectivity.12 Many subsequent works showed that highly infectious synthetic prions could not be generated in vitro without the addition of cofactors.13,14 In fact, PrP is considered a ‘promiscuous’ protein because of its ability to bind to different classes of macromolecules, such as nucleic acids (NAs), lipids, glycosaminoglycans, or even metallic ions; all these cofactors have been shown to trigger changes in PrP conformation leading to aggregation and toxicity.15-19 It appears that the minimal components necessary to facilitate PrP in vitro conversion and promote de novo prion formation with higher degree of infectivity are polyanions, mainly nucleic acid (NAs) molecules or lipids.20-22 The challenging task of creating recombinant prions that hold strain-like conformational characteristics and infectivity responds to the difficulty in reproducing an in vitro environment with proper facilitating factors, such as molecular crowding, the presence of chaperones and proteases, continuous synthesis of the protein in the ribosome or the presence of interacting NAs or lipids. In this context, modeling prion amyloid formation inside simple organisms might provide a system to recapitulate prion protein aggregation under more biologically relevant conditions.23 In many instances, heterologous protein expression in bacteria results high intracellular protein concentration, where the aggregation pathway tend to dominate over the folding one, and thus insoluble deposits of the recombinant protein are formed. Different studies showed that amyloidogenic proteins, when expressed in bacteria, form inclusion bodies with common structural and functional features with the

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highly ordered aggregated amyloids found in remaining question is whether, like their fungal the original host species.24,25 counterparts, mammalian prions could form The first characterization of the amyloid amyloid intracellular aggregates when properties of the bacterial IBs formed by a expressed in bacteria. We have answered this prionic protein was that of the fungal HET-S question in our recent paper33 where we prion protein.26 Transmission electron micros- selected two mammalian prion constructs, the copy (TEM) combined with solid-state NMR wild-type murine PrP encompassing residues spectroscopy revealed that E. coli IBs of the 23-231 (PrPWT) and the C-terminal domain of HET-s prion forming domain consist of fibrillar murine PrP (PrP90–231), and expressed them in structures that are almost identical to the bacteria. As expected, recombinant PrPs accumolecular structure of HET-s amyloid fibrils mulate in the insoluble bacterial fraction as assembled in vitro; and these HET-s IBs also IBs. We purified and studied the conformashowed prion infectivity when transfected into tional characteristics of the PrPs IBs, as well as the natural host.26 Another report provided their biochemical strain-like properties. Our clear evidence that the bacterial cytoplasm can recent study provides the first demonstration support the formation of infectious prion aggre- that PrPs from mice can form amyloids inside gates, as shown for the NM-Sup35 yeast pro- bacterial IBs with common characteristics to tein.27 The NM-Sup35 bacterial IBs where later PrP amyloids formed in vitro or even the amyshown to possess amyloid-like properties. The loid PrPSc in vivo. Moreover, although possessinfectivity of these aggregates was modulated ing similar secondary structure, PrPWT IBs and by the environmental conditions in which they PrP90-231 IBs exhibit conformational diversity, were formed.28 Importantly, the NM-Sup35 as they bind to amyloid dyes (Congo red and prion conformation can be propagated in bacte- thioflavin T) at different levels, possess differria for over a hundred generations, even when ent morphology, different stability against the cells can no longer produce the protein that urea-induced unfolding and also different resisserves as the trigger for the initial conversion.19 tance to proteinase K digestion. It is known that Seminal work from Giraldo’s group showed amyloid spread requires a high degree of that N-terminal domain of a bacterial protein, sequential and conformational specificity; only RepA, could form amyloid-like fibrils within amyloids with sequence identity can form bacteria upon interaction with defined double- cross-b-sheet interactions able to be incorpostranded DNA sequences.29 This protein, when rated into the amyloid fibrils. This sequential/ modified, generated a prion-like disease in bac- conformational specificity is probably responsiteria that can be transmitted from mother to ble for the species barrier between two different daughter cells.30 More recently, this group prions. However, the rules dictating the species showed that this bacterial prionoid can seed barriers as well as effects of the environmental amyloid aggregation of mutants from the same conditions on that barrier are still not clear. In protein,31 and characterized the bacterial nucle- our study, we show that the PrPWT amyloid IBs oid as the initial site of assemble of these prion- are able to seed in vitro the amyloid polymerilike aggregates.32 This bacterial amyloidosis, zation of purified recombinant PrPWT, reducing shared some characteristics with mammalian the lag-phase of the sigmoidal reaction. But, prion diseases, mainly transmissibility and the interestingly, when we tried to seed the same presence of phenotypically distinct strains. reaction with the PrP90-231 IBs, we could not Altogether, those observations provided accelerate the polymerization, which indicates solid evidences that the IBs molecular structure that, despite the fact that the 2 PrP forms share can resemble the architecture of amyloid fibrils, ~70% of the sequence, the lack of sequential in such a way that both the prion strain phe- identity at the N-terminus and/or the different nomenon and the infectious nature, which are structural properties of the aggregates, preclude dependent on the specific protein conforma- the establishment of appropriate protein-protein tional state, seem to be conserved in these mor- contacts. Finally, the conformational differenphologically different aggregates deposits. A ces among the PrPs IBs result in different

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toxicity of the 2 PrP IBs resistant cores after PK-digestion when added to neuroblastomacultured cells. We believe that the intracellular aggregates retain strain-like features, a characteristic unique for prion proteins (from yeast and mammals). We show that some of these features, such as different migration pattern after digestion with proteinase-K, and different stability are conserved after IBs extraction (Fig. 1).

APPLICATIONS OF BACTERIALLY GENERATED MAMMALIAN PRION AMYLOIDS There are several proposals for the structure of infectious PrPSc, but to date there is still no consensus about the 3D high-resolution conformation of the scrapie PrP.34-36 One of the main challenges is to obtain homogeneous material from infected brain in sufficient amount for the structural studies. Besides, there are also safety limitations for the study of bona fide infectious mammalian prions. Although there are obvious differences in post-translational changes in the prokaryotic and eukaryotic cytoplasm, the generated recombinant prion proteins might become a valuable source of homogeneous but conformationally different assemblies produced with high yield for future transmissibility and structural studies. Besides, our bacteria-generated mammalian PrPs might be useful as seeds for amplification of strainspecific prions and their subsequent study, in protocols such as PMCA (protein misfolding cyclic amplification) and RT-QuIC (real time quaking induced conversion).37,38 Our prionforming system can also be used for the screening of drugs that inhibit aggregation and amyloid formation, as already proposed for other amyloid proteins.23

CONCLUSION AND PERSPECTIVES Our previous work provided clear experimental evidence that yeast prions can form amyloids in prokaryotes that can be transmitted

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to na€ıve yeasts that will gain the prion-state, confirming infectivity.28 Recently, we demonstrated that modeling mammalian PrP amyloids inside bacteria might be a useful tool to understand the conformational variability of prions. We showed that the IBs obtained upon expression of mammalian PrP in bacteria contain seeding competent amyloid-like structures. We need to get now a more detailed picture about the neurotoxic activity of these IBs. It remains to be confirmed in vivo if we are recapitulating a real prion strain phenomenon. We are performing in vivo experiments to check if PrP IBs can trigger the conversion of host PrP into an aggregated state that retains the PK-resistance and the stability profiles of the seed. Our next study will answer whether bacteria-produced mammalian PrP IBs have only amyloid nature or are indeed infectious to mammals and can be considered bona fide prions (Fig. 1). For that purpose, PrP IBs will be administered to healthy transgenic mice by intracerebral injection and the animals will be evaluated for disease progression. Clinical and histopathological parameters will be followed to identify prion disease characteristics. If clinical symptoms of TSE appear, disease-incubation time and western blot analysis of brain-derived material will be assessed to see whether they correlate with strain-like properties of different inoculated IBs. Overall, despite speculative, the possibility that mammalian prion amyloid assemblies generated in bacteria would display transmissible and infectious properties in mammalian hosts is worth to be explored, since it would open a myriad of novel opportunities to study the structure and biology of these intriguing proteins.

ABBREVIATIONS IB PrP TSE

inclusion body prion protein transmissible spongiform encephalopathy

DISCLOSURE OF POTENTIAL CONFLICTS OF INTEREST No potential conflicts of interest were disclosed.

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B. Macedo et al.

FIGURE 1. Mammalian PrP IBs formation in bacteria and their characterization by different techniques. Two constructs of murine PrP were selected (1) and E. coli cells were transformed with plasmids harboring either PrPWT or PrP90-231 cDNAs (2). Induction of recombinant expression of both PrPs resulted in their accumulation in the insoluble bacterial fraction, known as IBs, which were purified upon appropiated cell lysis and extensive washing (3). SDS-PAGE analysis revealed that both PrP IBs are constituted mainly by the recombinant mammalian PrPs (4). Transmission electron microscopy, binding to amyloid-specific dyes and FTIR spectroscopy analysis of isolated PrPs IBs revealed that mammalian PrPs IBs possess an amyloid-like nature (5). Furthermore, digestion with proteinase-K (PK), seeding of the amyloid polymerization reaction and stability studies (6), indicate that these IBs may display prion strain-like properties. It remains to be investigated whether the isolated mammalian PrPs IBs behave as true infectious entities upon intracerebral injection in mice. Accordingly, clinical and histopathological features, as well as transmissibility will be followed to confirm the development of prion disease characteristics in animal models.

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FUNDING This work was supported by Ministry of Education of Brazil [CAPES process number: 99999.002869/2014-04 to the fellow student B. M]; and by Ministerio de Economia y Competividad, Spain [BFU2013-44763-P to S.V.]; by ICREA [ICREA Academia 2009 to S.V.] and by FAPERJ, CNPq and INBEB from Brazil to Y.C. REFERENCES [1] Prusiner SB, Prusiner SB, Scott MR, Scott MR, DeArmond SJ, DeArmond SJ, Cohen FE, Cohen FE. Prion protein biology-review. Cell 1998; 93:337-48; PMID:9590169; http://dx.doi.org/ 10.1016/S0092-8674(00)81163-0. [2] Caughey B, Baron GS, Chesebro B, Jeffrey M. Getting a grip on prions: oligomers, amyloids, and pathological membrane interactions. Annu Rev Biochem 2009; 78:177-204; PMID:19231987; http://dx. doi.org/10.1146/annurev.biochem.78.082907.145410. [3] Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 1982; 216:136-44; PMID:6801762; http://dx.doi.org/10.1126/science. 6801762. [4] Alper T, Cramp WA, Haig DA, Clarke MC. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature 1967; 214:764-6; PMID:4963878; http://dx. doi.org/10.1038/214764a0 [5] Griffith JS. Nature of the scrapie agent: self-replication and scrapie. Nature 1967; 215:1043-4; PMID: 4964084; http://dx.doi.org/10.1038/2151043a0 [6] Brettschneider J, Tredici K Del, LeeVM-Y, Trojanowski JQ. Spreading of pathology in neurodegenerative diseases: a focus on human studies. Nat Rev Neurosci 2015; 16:109-20; PMID:25588378; http:// dx.doi.org/10.1038/nrn3887. [7] Chiti F, Dobson CM. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 2006; 75:333-66; PMID:16756495; http://dx.doi. org/10.1146/annurev.biochem.75.101304.123901. [8] Guo JL, Lee VMY. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med 2014; 20:130-8; PMID:24504409; http:// dx.doi.org/10.1038/nm.3457. [9] Baskakov IV. Switching in amyloid structure within individual fibrils: Implication for strain adaptation, species barrier and strain classification. FEBS Lett 2009; 583:2618-22; PMID:19482025; http://dx.doi. org/10.1016/j.febslet.2009.05.044. [10] Bruce ME, McConnell I, Fraser H, Dickinson AG. The disease characteristics of different strains of scrapie in Sinc congenic mouse lines: implications

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10. DISCUSSÃO GERAL Nessa tese desenvolvemos e aplicamos diferentes abordagens, englobando estudos in vitro e in vivo, para compreender os mecanismos de patogênese da proteína prion (PrP), uma proteína especial por descrever um novo fenômeno dentro da biologia molecular onde o termo prion – hoje - reflete as habilidades de uma determinada proteína sozinha de sofrer autoconversão, autopropagação e disseminação entre as células vizinhas. A hipótese protein only, que é amplamente aceita propõe que o agente etiológico das encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs) é uma molécula de natureza inteiramente proteica onde algumas conformações anormais adotadas pela PrP podem apresentar características infecciosas e transmissíveis, que estão envolvidas com a deflagração e progressão desse grupo de doenças. Entretanto, vêm crescendo as evidências que suportam a hipótese dos cofatores moleculares que podem auxiliar a interconversão estrutural da PrPC em PrPSc e promover a propagação de prions (CORDEIRO et al., 2001; DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003; MILLER et al., 2013; SILVA; CORDEIRO, 2016; TELLING et al., 1995). A capacidade de estruturas mal formadas da PrP de se autopropagar é melhor demonstrada em ensaios de conversão in vitro, porém os ensaios como o RT-QuIC (ATARASHI et al., 2011), que ocorrem na ausência de células, utilizando a PrPSc purificada como semente para conversão da PrPC, são bem menos eficientes do que ensaios como PMCA, que utilizam como sementes homogenatos de cérebro infectado (CASTILLA et al., 2005; LEGNAME et al., 2004). A diferença de eficiência entre esses dois ensaios é uma grande alerta para a participação de cofatores, que devem estar presentes nesses homogenatos e que podem estimular a propagação mais eficiente de prions. Nesse contexto, os ácidos nucleicos (NAs) vêm sendo apontadas como potenciais cofatores moleculares da PrP, que é capaz de se ligar a essas moléculas com alta afinidade tanto in vitro como in vivo (CORDEIRO et al., 2001; DELEAULT; LUCASSEN; SUPATTAPONE, 2003; MACEDO et al., 2012; SUPATTAPONE, 2014). Estudos realizados em nosso laboratório foram pioneiros na caracterização estrutural do complexo PrP-NAs e nos efeitos resultantes dessa interação (CHAVES et al., 2014; CORDEIRO et al., 2001; GOMES; CORDEIRO; SILVA, 2008; LIMA et al., 2006; MACEDO et al., 2012). No primeiro capítulo desta tese, expandimos nossos conhecimentos sobre a interação da rPrP com pequenas sequências de DNA e RNA e discutimos aspectos 167

importantes dessa interação. Estávamos muito interessados em determinar quais eram os padrões presentes na molécula de ácido nucleico que dirigiam essa interação e eram responsáveis pelos diferentes efeitos observados na agregação, estrutura e estabilidade da proteína. A interação de proteínas com ácidos nucleicos pode ser estabilizada por diversas forças moleculares, incluindo ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Vimos que o tamanho do ácido nucleico é importante para garantir maiores efeitos na alteração da estrutura tridimensional da PrP, provavelmente porque pode proporcionar maiores números de contatos intermoleculares com a proteína, mas observamos que existem determinantes mais específicos, como a conformação particular adotada por cada oligonucleotídeo, garantindo efeitos distintos após ligação a rPrP. Os oligonucleotídeos com maior conteúdo de bases GC (D44G e D67s) foram capazes de promover a formação de estruturas agregadas da rPrP com alta estabilidade à desnaturação por temperatura. Em especial, a interação com D67s se mostrou ainda mais peculiar promovendo profundas mudanças na conformação da proteína, que passa a ter seus resíduos de triptofano totalmente protegidos da acessibilidade ao solvente, em estruturas agregadas mais termicamente estáveis do que em comparação com outros oligonucleotídeos. Já havíamos estabelecido que a sequência com maior conteúdo de GC (D67) era capaz de induzir uma maior de agregação da PrP e formar estruturas mais tóxicas para cultura de células neuronais (MACEDO et al., 2012). Mostramos aqui que alterações nas posições dessas bases, em oligonucleotídeos de mesma sequência como D67 e D67s, modifica a estrutura do DNA e altera os efeitos resultantes da interação com a rPrP. A importância da estrutura do ácido nucleico fica ainda mais evidente quando comparamos a interação da rPrP com moléculas de DNA e RNA que apresentam formas completamente distintas. A interação da PrP com RNA induz maior agregação da proteína e pode ocorrer em sítios diferentes em comparação com o DNA (GOMES et al., 2008; LIMA et al., 2006). De fato, vimos que os oligonucleotídeos com maior conteúdo de GC (D67 e D67s) apresentam conformações similares a de moléculas de RNA, a forma-B, mas não são idênticos entre si, o que pode explicar as particularidades de interação de cada um. Por essas razões, estabelecemos que o polimorfismo estrutural de pequenas moléculas de ácidos nucleicos é o principal fator responsável pelos diferentes efeitos resultantes da comunicação ente PrP e NA. A grande variedade de motivos estruturais presentes tanto na PrP como nos oligonucleotídeo torna muito complicado estabelecer um 168

modelo de interação único, cada complexo rPrP:DNA deve adotar uma conformação particular que somente poderia ser revelada por técnicas de alta-resolução estrutural como RMN. Em 2009, o grupo de Mashima reportou pela primeira vez a estrutura em alta resolução do oligonucleotídeo de alta afinidade contra a PrP bovina selecionado por SELEX, chamado de aptâmero R12, as análises de RMN revelaram que a sequência GGAGGAGGAGGA (R12) forma uma estrutura de G-quadruplex intramolecular (MASHIMA et al., 2009). O G-quadruplex é formado por sequências ricas em guanina, que podem se organizar num arranjo em quadrado de guaninas (uma tétrade) estabilizado por ligações de hidrogênio (paramento de Hoogsteen) onde duas ou mais tétrades podem ser pareados uma no topo da outra (BURGE et al., 2006). A maioria dos aptâmeros encontrados por esse grupo apresenta repetições de GGA e se ligam com alta afinidade tanto na PrPC como em conformações próximas a PrPSc (MASHIMA et al., 2009; MURAKAMI et al., 2008). O DNA sintetizado com a mesma sequência, D12, também pode se ligar a PrP, mas a afinidade é menor para ambas as formas da proteína (CAVALIERE et al., 2013). As repetições de GGA facilitam a formação de G-quadruplex que pode ser o padrão estrutural de ácidos nucleicos que garanta a maior especificidade de interação pela PrP. Estudos de RMN também proveram a primeira caracterização estrutural fina do complexo formado entre peptídeos do domínio N-terminal da PrP com R12 (MASHIMA et al., 2013) (FIGURA 54). A estrutura do quadruplex é preservada mesmo após a interação com a PrP, e o R12 se associa em dímeros onde cada monômero se liga simultaneamente a duas porções do N-terminal da PrPC, o que explicar a forte interação com esse oligonucleotídeo, aonde interações eletrostáticas e de pareamento dirigem a afinidade de cada porção (MASHIMA et al., 2013).

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FIGURA 54. Arquitetura do complexo entre PrP bovina e o aptâmero R12. O aptâmero R12 forma dímeros de G-quadruplex, um monômero em plano hexagonal e o outro em plano quadrático. Os resíduos de lisina e guanosina envolvidos nas interações eletroestáticas estão coloridos em laranja, e o triptofano e a guanosina envolvida na interação de pareamento estão coloridos em azul. A estrutura da região C-terminal da PrP bovina foi desenhada com base nas coordenadas acessadas pelo PDB 1DX0. Figura retirada de (MASHIMA et al., 2013)

Vale destacar também que G-quadruplex também são capazes de induzir mudanças conformacionais na PrP após ligação, semelhantes aquelas que vimos. Interessantemente, o RNA mensageiro da PrP contem regiões com alta propensão a formar G-quadruplex dependendo de condições ambientais, como variações nos níveis de potássio, e essas regiões poderiam interagir com a própria proteína, e estar envolvidas com a sua patofisiologia (OLSTHOORN, 2014). Devido a essas características especiais e por se apresentarem como um dos ligantes de maior afinidade da PrP, mais estudos devem focar nessas interessantes estruturas terciárias de ácidos nucleicos, que são fortes candidatas a cofatores da conversão da PrP, mas que também podem ser promissores no desenvolvimento de terapia e de métodos diagnósticos. A seleção de novos aptâmeros tem sido realizada por pesquisadores para investigar a interação PrP-NA, permitindo caracterizar complexos que merecem 170

investigações futuras. Apesar de identificar DNAs ou RNAs de alta afinidade contra a PrP e seus domínios, os protocolos de SELEX aplicados por diferentes laboratórios podem apresentar pequenas modificações e, por isso, para obter um melhor entendimento sobre essas interações é importante que as caracterizações estruturais e biofísicas de cada complexo PrP-Aptâmero sejam comparadas quando resultantes das mesmas condições de seleção em um único estudo. Por isso, realizamos o nosso próprio processo de SELEX para identificar novos aptâmeros contra o domínio C-terminal globular estruturado da rPrP de camundongo (PrP90-231). A seleção dessa região é interessante pois está envolvida em muitos aspectos patológicos e fisiológicos da PrP: i) ela contém a região transmembranar (90-130) e seu zíper de glicina, que parcialmente se sobrepõe a região do peptídeo neurotóxico e amiloide PrP106-126; ii) ela apresenta determinados polimorfismos que estão associados com síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) em humanos e à susceptibilidade de transmissão de doenças por prions em animais (AGUZZI; POLYMENIDOU, 2004; KOVÁCS et al., 2002). Validamos os aptâmeros identificados pela primeira vez nesta tese como sequências de alta afinidade contra a PrP90-231, que está intimamente envolvida com a conversão e propagação de formas infecciosas e pudemos comparar suas propriedades sobre a PrP e vimos que mesmo apresentado alta afinidade contra a PrP, os aptâmeros apresentam diferentes efeitos na agregação desta proteína. Entretanto, outras metodologias biofísicas precisam ser aplicadas, associadas com a caracterização estrutural em alta-resolução de cada complexo para que possamos realizar análises mais precisas dos sítios envolvidos nesta interação e dos padrões moleculares na molécula de ácido nucleico que guiam os diferentes efeitos sobre a PrP e que podem afetar as propriedades biológicas ou patológicas desta proteína. Além disso, sabemos que esses aptâmeros também podem se tornar moléculas promissoras nos campos de terapia e diagnóstico das doenças por prions. Vale lembrar que até hoje mesmo os aptâmeros que apresentaram eficácia terapêutica em modelos animais (KING et al., 2007; KOCISKO et al., 2006) não entraram em estudos clínicos. Mais estudos precisam ser organizados para avaliar o potencial dos aptâmeros aqui identificados na terapia e no diagnóstico, por exemplo, avaliando se eles são capazes de detectar conformações da PrP em fluidos e tecidos corporais de organismos acometidos pela doença. Para aprofundar nossas análises, avaliamos também o efeito in vivo da inoculação do complexo PrP:DNA em camundongos saudáveis, e verificamos também o efeito de 171

diferentes NAs em modelos de propagação de prions utilizando cérebros de animais infectados com PrPSc. Interessantemente, a interação com os mesmos oligonucleotídeos que mostramos ser capazes de induzir a conversão estrutural e agregação imediata da forma celular da rPrP in vitro, pode promover a formação de estruturas tóxicas da PrP para modelos in vivo. Nossos resultados mostram que a inoculação do complexo rPrP:D67 em camundongos saudáveis promove efeitos subclínicos de disfunção cognitiva. Por outro lado, vimos que os mesmos oligonucleotídeos também são capazes de inibir a propagação de duas cepas infecciosas distintas de prion (22L e RML) e de reduzir o acúmulo de PrPSc em modelos de conversão com cérebros infectados com a cepa 263K. Os diferentes efeitos observados podem estar relacionados com diferentes afinidades de interação do DNA pela PrPC e PrPSc, que na presença das duas formas podem ter maior afinidade pela última. Em geral, vimos que muitos aptâmeros que se ligam a PrPC também interagem com a PrPSc, e se a interação com a PrPSc estabilizar essa forma ou alterar sua estrutura podemos esperar que ela perca sua capacidade inerente de autopropagação. Além disso, a proteína ancorada a superfície da célula muito provavelmente não tem a mesma facilidade de sofrer as profundas mudanças conformacionais e agregação que vemos in vitro, e por isso sugerimos que o local de interação entre essas duas moléculas seja também um fator importante para determinar o papel desses oligonucleotídeos como facilitadores ou inibidores da conversão da PrP. Diversas outras topologias, menos recorrentes, já foram identificadas para a PrP, incluindo formas citosólicas, transmembranares e, até mesmo, nucleares onde já foram encontradas interagindo com elementos da cromatina de células neuronais e endócrinas (MANGÉ e et al., 2004; STROM e et al., 2011). O que fica claro, aqui, é que essas duas moléculas podem conversar de tal maneira que é possível modular a conversão da PrP para o bem ou para o mal. O primeiro indício desse duplo papel do DNA foi identificado in vitro pelo nosso grupo em 2001, através de ensaios simples de agregação, onde a interação da PrP23-231 com uma sequência de DNA induzia a agregação imediata da proteína, mas também era capaz de inibir a agregação de PrP109-149 (CORDEIRO et al., 2001). Resultados contemporâneos obtidos por outros grupos de pesquisas respaldam a nossa teoria inicial e mostram que oligonucleotídeos de RNA livres, extraídos de depósitos amiloides altamente infecciosos da PrP, quando incubados com a PrPC é capaz de promover a conversão da PrPC em PrPSc que adquire características infecciosas e 172

podem causar a doença de prion quando inoculada em hamsters sírios saudáveis (SIMONEAU et al., 2015). Foi observado também uma redução no título infeccioso de duas cepas distintas de prions quando eram tratadas com determinadas nucleases (BOTSIOS; MANUELIDIS, 2016). Nossos estudos de interação da PrP e de suas diferentes construções com aptâmeros e outros ácidos nucleicos ligantes, comprovam que essa proteína pode ligar diferentes sequências de ácidos nucleicos com faixas de afinidades distintas que podem guiar diferentes efeitos na estrutura, agregação e toxicidade da proteína. Os efeitos mais diferenciados induzidos por ácidos nucleicos específicos podem estar envolvidos na produção de conformações patogênicas infecciosas da PrP. Nossos resultados sugerem ainda que a proteína pode perder a afinidade pelo DNA após a conversão, mas a nova estrutura formada é mantida e estabilizada e poderia ser utilizada como molde molecular para conversão de formas celulares normais. Por isso, nossa teoria inicial ganha força nesta tese que não refuta a hipótese amplamente aceita de que os prions são partículas infecciosas de natureza inteiramente proteica, mas complementam a essa visão a participação de moléculas que atuem como cofatores desse processo patogênico. Uma característica importante e muito debatida sobre a PrP é a existência de múltiplas cepas infecciosas, que estão relacionadas com as diferentes estruturas que podem ser adotadas pela PrPSc. As cepas de prions são responsáveis pela grande variedade de fenótipos observados para as EETs, como a duração do tempo de incubação da doença, a região de acúmulo e lesão no cérebro, e a agressividade dos danos histopatológicos. Muitos esforços têm sido dedicados para recriar prions infecciosos in vitro e estudar suas características estruturais, mas os resultados têm mostrado que prions sintéticos altamente infecciosos só podem ser gerados com a adição de cofatores moleculares. O grande desafio de gerar prions recombinantes que sustentem as propriedades conformacionais de cepas infecciosas da PrP deve estar relacionado com a dificuldade em reproduzir in vitro um ambiente mais propício, com a presença de fatores facilitadores como: molecular crowding, a presença de chaperonas e proteases, a síntese continua da cadeia polipeptídica no ribossomo e além da presença de cofatores moleculares como ácidos nucleicos e lipídeos. No segundo capítulo desta tese, fomos capazes de estabelecer um modelo rápido e eficiente para estudar a agregação da PrP na presença de todos os fatores citados acima. Através da avaliação dos corpos de inclusão da PrP de mamífero, formados in vivo dentro células bacterianas, identificamos a formação de agregados amiloides da PrP que 173

apresentam diferentes estruturas, estabilidade, toxicidade e perfil de resistência à digestão por PK, dependendo da construção da PrP incorporada no genoma da bactéria (MACEDO et al., 2015; MACEDO; CORDEIRO; VENTURA, 2016). É evidente que o citoplasma de bactérias onde esses agregados foram gerados difere bastante das células eucarióticas, entretanto o potencial desses agregados amiloides, que compartilham muitas características da forma PrPSc, se aproximarem das conformações infecciosas e causarem doenças é, em nossa opinião, muito maior que o de agregados sintéticos formados com a rPrP purificada in vitro, que precisa tipicamente ser tratada com agente desnaturante; sujeitada a vários ciclos de sonicação ou agitação, e incubadas com fatores adjuvantes purificados ou sintéticos. Nossos resultados apresentados e discutidos extensivamente no segundo capítulo desta tese mostram que esse modelo de estudo da PrP dentro de organismos simples pode recapitular o processo de agregação da PrP sobre condições biológicas mais relevantes e fornecer quantidades suficientes de estruturas similares à PrPSc para futuros estudos estruturais, de infecção e de transmissão.

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11. CONCLUSÕES  Moléculas de ácidos nucleicos, DNA e RNA, interagem com a proteína prion (PrP) com alta afinidade na faixa de nanomolar à micromolar, mas com especificidades diferentes, promovendo diferentes efeitos de modulação da agregação da PrP e de alterações de estrutura secundária e terciária de PrP.  O tamanho dos oligonucleotídeos de DNA é importante para garantir maiores efeitos na alteração da estrutura tridimensional da PrP, mas o polimorfismo estrutural de pequenas moléculas de ácidos nucleicos é o principal fator responsável em guiar a interação mais específica com a PrP resultando em efeitos distintos sobre as características estruturais e biofísicas da PrP, dependendo da sequência de DNA.  Os parâmetros termodinâmicos de interação da PrP com ácidos nucleicos apresentam valores distintos, mas são classicamente reações exotérmicas de alta afinidade; e a estequiometria de ligação PrP-DNA e PrP-RNA ocorre na razão molar (PrP:Ácido Nucleico) de 0,5:1 e 0,2:1, respectivamente.  Os oligonucleotídeos de DNA avaliados neste trabalho são capazes também de inibir a propagação de duas cepas infecciosas distintas de prion (22L e RML) em cultura de células de neuroblastoma permanentemente infectadas com prion (ScN2a).  Os oligonucleotídeos de DNA são capazes de reduzir o acúmulo da forma resistente da PrP, que estão associada às doenças, em modelos de conversão de PrP recombinante in vitro, livre de células, utilizando como semente para conversão uma quantidade mínima de extrato cérebros infectados com a cepa 263K.  O efeito in vivo da inoculação do complexo PrP:DNA em camundongos saudáveis promove efeitos significativos em relação aos controles de disfunção cognitiva avaliados por testes comportamentais, mas aparentemente não alteram a função motora desses animais.  Selecionamos e validamos novos aptâmeros de DNA de alta afinidade contra o domínio globular da PrP compreendo os resíduos 90-231 por SELEX e estimamos os parâmetros termodinâmicos de interação do aptâmero A1 e A2 com a PrP90-231 e a sua forma inteira PrP23-231.

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 Os aptâmeros A1 e A2 possuem maior afinidade pela PrP do que os oligonucleotídeos individualmente selecionados neste trabalho (D44 e D67) e promovem diferentes efeitos na modulação da agregação da PrP.  Os ácidos nucleicos se mostraram potenciais cofatores da conversão da PrP podendo auxiliar a interconversão estrutural da PrPC em PrPSc e modular a propagação de prions.  Estabelecemos um sistema simples e rápido para produção de agregados amiloide da PrP in vivo, na forma de corpos de inclusão no interior de células de Escherichia coli.  Os corpos de inclusão da PrP de mamíferos, produzidos dentro de bactérias, podem conter estruturas amiloides com diferentes conformações, apresentando diferente estabilidade, toxicidade e perfil de resistência à digestão por PK, dependendo da sequência da PrP incorporada no genoma da bactéria.

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Pathological implications of nucleic acid interactions with proteins associated with neurodegenerative diseases Yraima Cordeiro & Bruno Macedo & Jerson L. Silva & Mariana P. B. Gomes

Received: 28 July 2013 / Accepted: 3 December 2013 # International Union for Pure and Applied Biophysics (IUPAB) and Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2013

Abstract Protein misfolding disorders (PMDs) refer to a group of diseases related to the misfolding of particular proteins that aggregate and deposit in the cells and tissues of humans and other mammals. The mechanisms that trigger protein misfolding and aggregation are still not fully understood. Increasing experimental evidence indicates that abnormal interactions between PMD-related proteins and nucleic acids (NAs) can induce conformational changes. Here, we discuss these protein–NA interactions and address the role of deoxyribonucleic (DNA) and ribonucleic (RNA) acid molecules in the conformational conversion of different proteins that aggregate in PMDs, such as Alzheimer’s, Parkinson’s, and prion diseases. Studies on the affinity, stability, and specificity of proteins involved in neurodegenerative diseases and NAs are specifically addressed. A landscape of reciprocal effects resulting from the binding of prion proteins, amyloid-β peptides, tau proteins, huntingtin, and α-synuclein are presented here to clarify the possible role of NAs, not only as encoders of genetic information but also in triggering PMDs.

Keywords Protein aggregation . Protein misfolding . Protein–nucleic acid interaction . Degenerative diseases . Conformational conversion Special Issue Advances in Biophysics in Latin America Y. Cordeiro : B. Macedo : M. P. B. Gomes Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-902, Brazil J. L. Silva Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-902, Brazil Y. Cordeiro (*) Cidade Universitária, Av. Carlos Chagas Filho 373, Prédio do CCS, Bloco B, Subsolo, Sala 17, Rio de Janeiro, RJ 21941-902, Brazil e-mail: [email protected]

Abbreviations AD α-syn HD Htt PD PrP PK rPrP TSE

Alzheimer’s disease alpha-synuclein Huntington’s disease huntingtin Parkinson’s disease prion protein proteinase K recombinant prion protein transmissible spongiform encephalopathy

Introduction Protein folding and misfolding are critical processes responsible for regulating either a protein’s biological activity or its cellular location. A great number of biologically active proteins must form oligomers to become active. Structural proteins such as actin and tubulin form sophisticated supramolecular complexes that execute important physiological roles. The formation of these oligomers and functional supramolecular complexes is tightly controlled and important for many cellular functions. On the other hand, misfolded proteins can oligomerize to an uncontrolled and undesired form and are considered potential driving forces in the development of many human diseases. When several naturally expressed proteins in vivo are incapable of folding correctly into their native structures, they can cause typically age-related diseases termed protein misfolding disorders (PMDs), which include Alzheimer’s (AD), Parkinson’s (PD), and prion diseases, or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) (reviewed in Chiti and Dobson 2006). The common pathogenic hallmark of each of these disorders is the misfolding and aggregation of a

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particular protein, i.e., the β-amyloid peptide (Aβ) for AD, αsynuclein (α-syn) for PD, and prion protein (PrP) for TSEs (Table 1). Protein aggregation can proceed in a well-organized fashion to form amyloid fibrils, which are different than amorphous protein aggregates (Fig. 1). The Nomenclature Committee of the International Society of Amyloidosis (ISA) defines amyloid fibrils as proteins that are deposited in human/animal tissues and bind Congo red with high affinity, resulting in green birefringence under polarized light (Sipe et al. 2012). Although amyloid fibrils are a hallmark of the neurodegenerative diseases discussed in this review, less organized or amorphous aggregates can also be associated with PMDs (Ecroyd and Carver 2008). In general, both amyloid and amorphous aggregates are more stable and less hydrated than native, intermediate, and unfolded states (Fig. 1) (Silva et al. 2010a). The mechanisms that drive a biologically active and soluble protein to adopt an alternative structure with high potential for aggregation depend on the different intermediates formed during the folding process, the energy states of these intermediates, the energy barriers separating these states, and the hydrophobic surface exposed to an aqueous medium (Silva et al. 2010a). The aging process reduces protein quality control mechanisms in some tissues, and these tissues gradually lose their capacity to prevent the accumulation of abnormally formed proteins (Dobson 2001; Bonini 2002; Brignull et al. 2007). This phenomenon might explain the high incidence of PMDs among the elderly. Mutations or abnormal posttranslational modifications, as well as exposure to environmental variations or external agents, could also trigger protein misfolding and aggregation (Uversky 2010). Exposure to external agents could facilitate protein interactions with molecules that are not their native partners, such as nucleic acids (NAs), other proteins, lipids, glycosaminoglycans, or even metallic ions; all these molecules have been previously shown to trigger changes in protein conformation leading to aggregation (Atwood et al. 1998; Uversky et al. 2001; Silva et al. 2010b; Liu and Zhang 2011; Ma 2012).

For the last 20 years, nucleic acids (NAs) have been described as possible cofactors that bind amyloidogenicprone proteins and facilitate the aggregation process (Cordeiro et al. 2001; Deleault et al. 2003; Yin et al. 2009; Jiménez 2010; Di Domizio et al. 2012). Protein interactions with NAs are based on a series of molecular contacts, including hydrogen bonding mediated by water molecules, nonpolar contacts, and hydrophobic interactions. Although some amino acid residues interact preferentially with NAs (Luscombe et al. 2001), the various structural motifs in proteins and NAs, as well as nucleotide variations, make it difficult to establish a single model for protein–NA interactions (reviewed in Rohs et al. 2010). As discussed, a number of research groups have reported nonnative interactions between proteins and NAs in the past few years. These interactions cause, in many cases, protein misfolding and aggregation in vitro and are related to early degenerative disease events that are not completely understood (Nandi and Leclerc 1999; Cordeiro et al. 2001; Deleault et al. 2003; Gomes et al. 2008a; Di Domizio et al. 2012; Camero et al. 2013a). Interestingly, NAs can prevent protein aggregation in some cases and have also been used as tools for developing diagnostic strategies (Cordeiro et al. 2001; Keefe et al. 2010). Prionlike aggregation of mutants of tumor suppressor p53, a DNA-binding protein, has also been implicated in the pathophysiology of cancer (Ishimaru et al. 2003; Ano Bom et al. 2012; Silva et al. 2013). Interestingly, binding of cognate-DNA prevents aggregation of wild-type p53 (Ishimaru et al. 2009). In this review, we will focus on the abnormal interactions of PMD-linked proteins (Table 1) with nucleic acid molecules that do not participate as coding agents but as cofactors in conformational conversion reactions. Specifically, abnormal interactions with NAs will be discussed for prion proteins, Aβ, tau, huntingtin (htt), and α-syn. Different biophysical characteristics of protein–ribonucleic acids and protein–deoxyribonucleic acids will also be addressed.

Table 1 Proteins and neurodegenerative diseases Protein

Aggregation site

Associated disease

Fibril characteristic

Acquired or hereditary

PrP

Central nervous system, extracellular

α-syn

Central nervous system, extracellular Neurons, intracytoplasmic

Amyloid, amorphous aggregate, organized aggregates Amyloid

A/H

Aβ

Transmissible spongiform encephalopathies Alzheimer’s disease

Tau

Neurons, intracytoplasmic

Huntingtin

Neurons, intranuclear

Adapted from Sipe et al. (2012)

A

Parkinson’s disease

Amyloid

A/H

Alzheimer’s diseases and other cerebral conditions Huntington’s Disease

Amyloid

A

Amyloid

H

Biophys Rev Fig. 1 Free energy and hydration landscape of the protein-folding funnel. Unfolded proteins are highly flexible and hydrated. As the proteins begin to fold, more ordered intermediates that are less hydrated start to populate more stable parts of the funnel. In some cases, these intermediates can escape from the native folding pathway into metastable conformations, leading to the formation of aggregated species (ordered or amyloid) that are generally less hydrated. Modified from Silva et al. (2010a)

Interactions of proteins involved in PMDs with NAs: misfolding, aggregation and therapeutic strategies Proteins involved in PMDs, such as Aβ and tau protein (in AD), α-syn (in PD), PrPs (in TSEs), or even superoxide dismutase (in amyotrophic lateral sclerosis), form amyloid and other organized aggregates rich in β-sheet secondary structures (Ross and Poirier 2004; Sipe et al. 2012). Interestingly, almost all of these proteins have been shown to interact with nucleic acids (reviewed in Silva et al. 2008; Yin et al. 2009; Jiménez 2010); this interaction may modulate misfolding and aggregation, alter transcription patterns and result in toxic effects (Jiménez 2010; Silva et al. 2010b). Thus, many groups have hypothesized that some neurodegenerative diseases develop partly as the result of an aberrant interaction between a disease-related protein and a NA (Yin et al. 2009; Jiménez 2010; Silva et al. 2008; Silva et al. 2010b). An interesting report showed that interaction of a bacterial protein with specific DNA sequences promoted protein assembly into amyloid fibrils (Giraldo 2007), indicating a general mechanism for DNA-induced protein aggregation. Protein–DNA complex formation occurs mainly through hydrogen bonding between specific amino acid side chains and nucleic acid bases. Nevertheless, both electrostatic and van der Waals interactions between a number of amino acid residues and the DNA phosphate and deoxyribose groups bring the two molecules together to form an interaction. DNA-binding proteins primarily combine specific and nonspecific interactions (Luscombe et al. 2001), and proteins can bind DNA duplexes (double-stranded, dsDNA) either at the major or the minor grooves. Specific protein–DNA interactions depend not only on the nucleotide sequence of the DNA

binding site but also on the particular three-dimensional structure of both the protein and DNA (Rohs et al. 2010). Therefore, a mixture of direct and indirect (i.e., through water molecules) interactions is expected for most DNA-binding proteins. RNAs are more structurally diverse than DNA, although the latter can also be found in different conformations, such as hairpins, quadruplexes, and i-motifs (Fig. 2) (Chastain and Tinoco 1991). RNAs are flexible molecules, and this structural property allows them to perform different functions in the cell (Dinger et al. 2008) and to interact with different partners. During the last decade, a number of RNA molecules unable to encode proteins (ncRNAs) was identified, such as microRNAs and other small RNAs. Recent evidence suggests a variety of roles for these molecules in eukaryotic cells, suggesting that ncRNAs have specific and important cellular functions (Costa 2007). It is not surprising that these molecules interact with amyloid proteins and participate in protein misfolding and aggregation (Deleault et al. 2003; Gomes et al. 2008b; Yin et al. 2009). However, the amount of information regarding RNA interactions with proteins responsible for PMDs is scarce. Most reported interactions between amyloidogenic proteins and NAs involve DNA molecules, which are also discussed in this review. It is still debatable whether NA interactions with proteins related to PMDs are specific for a particular sequence, size, or NA conformation. Different effects on protein aggregation, aggregate morphology, and cytotoxicity in the formed aggregated species have been reported, depending on the binding partners in question (for both protein and NAs) (Hegde et al. 2003; Bera and Nandi 2007; Hegde and Rao 2007; Maloney and Lahiri 2011; Vasudevaraju et al. 2012; Macedo et al.

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Fig. 2 Nucleic acid secondary structure motifs. Top Types of DNA structures. a duplex DNA (antiparallel, intermolecular); b hairpin (antiparallel, intramolecular); c triplex (parallel, intermolecular); d Gquadruplex (antiparallel, intramolecular); e i-motif (intramolecular). Adapted with permission (license number: 3197650337266) from Jaumot et al. (2009). Bottom RNA secondary structure elements: f hairpin; g single stranded regions; h bulge loop; i internal loop; j multi-branched loop or junction. Modified with permission (license number: 3197650632969) from Chastain and Tinoco (1991)

2012). Experimental evidence is converging to the hypothesis that the NA conformation is indeed crucial for binding PMDrelated proteins, resulting in reciprocal conformational changes (Macedo et al. 2012; Cavaliere et al. 2013). Although most work has been carried out with DNA duplexes adopting the classical B-DNA conformation, both hairpins and Gquadruplexes (Fig. 2) have been shown to interact with PrP (Mashima et al. 2009, 2013; Cavaliere et al. 2013), and both tau and α-syn interact with conformation-specific GC-rich DNA (Vasudevaraju et al. 2012). Prion protein (PrP) Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) form a group of rare neurodegenerative and fatal conformational diseases that affect humans and other mammals (Prusiner 1998). Clinical manifestations of TSEs in humans include dementia, ataxia, insomnia, involuntary muscle contraction (myoclonus), and altered behavior (Prusiner 1998). All TSEs have been assigned to the same infectious agent with an abnormal conformation derived from a constituent protein, namely, the prion protein (PrP). TSEs, or prion diseases, are associated with an isoform of the innocuous cellular form of PrP (PrPC), which is known as the scrapie PrP (PrPSc).

Mature PrPC is composed of 209 amino acid residues, contains two glycosylation sites, and is normally attached to the outer portion of the plasma membrane by a GPI anchor (Prusiner 1998). The first NMR solution structure of PrP was determined by Riek et al. (1996). A comparative analysis of various PrP structures from different organisms demonstrates that all PrPs have a similar three-dimensional structure made of two structurally distinct domains, a flexible N-terminal region and a globular C-terminal domain that contains three α-helices and a small antiparallel β-sheet. A sulfur bridge connects the two cysteine residues located in the second and third helices (reviewed in Gomes et al. 2012). In contrast to PrPC, PrPSc is an insoluble protein, and it is partially resistant to proteolysis (therefore also named PrPRes), and has a tendency to aggregate and form amorphous aggregates and/or amyloid-like structures (Prusiner 1998). Changes in secondary structure appear to be the fundamental basis for the biochemical differences between PrPC and PrPSc; however, spontaneous conversion between the two isoforms is prevented by a high energetic barrier (Cohen and Prusiner 1998; Cordeiro and Silva 2005). PrP can interact with both DNA and RNA molecules, and most studies were carried out in vitro with recombinant PrP (rPrP). This protein is perhaps the richest model for addressing interactions between NA and amyloidogenic proteins. A great challenge to the prion field is to understand the PrPC to PrPSc conversion reaction. In this context, our group proposed that NA molecules act as catalysts, lowering the energy barrier between these two PrP conformations (Cordeiro and Silva 2005) (Fig. 3). Spectroscopic studies from other groups, including ours, showed that DNA molecules bind both PrP isolated domains and the recombinant full-length PrP (rPrP) to induce the formation of amorphous aggregates and amyloid fibrils (Nandi and Leclerc 1999; Cordeiro et al. 2001; Lima et al. 2006; Macedo et al. 2012). The first description of a DNA–PrP interaction revealed binding of the neurotoxic PrP peptide (PrP106–126) to a fluorescently labeled linearized plasmidial dsDNA derived from bovine papilloma virus, as reported by Nandi (1997). Subsequent publications, also based on spectroscopic techniques, have presented data on the formation of amyloid structures by PrP106–126 and the full-length rPrP induced by plasmids and synthetic dsDNA interactions (Nandi 1998; Nandi and Leclerc 1999). Our group was the first to show that DNA molecules have a dual effect on PrP conformation and aggregation. Light scattering, intrinsic fluorescence, and circular dichroism spectroscopy experiments revealed that dsDNA sequences (both small oligonucleotides, from 18 to 36 bp, to plasmids) were able to completely inhibit aggregation of hydrophobic PrP domains (the domains comprise PrP residues 109–149 and 109–141) (Cordeiro et al. 2001). In contrast to PrP hydrophobic domains,

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Fig. 3 PrPC➪PrPSc conversion energy diagram. Misfolding of PrPC (circle) into PrPSc (star) seems to be the central event in TSEs. The two PrP forms can be recognized by the dramatic changes in their secondary structure content; PrPC is mostly α-helical whereas PrPSc has a higher β-sheet content. They are separated by a large energetic barrier that is associated with PrP unfolding/refolding. I and U represent the intermediate and unfolded PrP states, respectively. The existence of this high-energy barrier raises the possibility of another biomolecule’s (such as NAs) involvement in this conversion reaction, which would act as an adjuvant factor by lowering the energy barrier between PrPC and PrPSc. Adapted from Silva et al. (2010b)

DNA binding to full-length rPrP induced aggregation and conversion into a β-sheet-rich species. We have therefore proposed that DNA is directly involved in PrP structural conversion, modulating the equilibrium between PrPC and PrPSc by reducing protein mobility and facilitating protein–protein interactions (Cordeiro et al. 2001; Cordeiro and Silva 2005). In a subsequent study, the rPrP:DNA complex was characterized using different rPrP constructions and a 21-bp DNA sequence. Nuclear magnetic resonance (NMR) and small angle x-ray spectroscopy (SAXS) measurements indicated that the globular C-terminal domain of rPrP directly binds to DNA, which was also observed by other groups. Nandi et al. (2002) observed that 950-bp dsDNAs were able to induce partial unfolding and aggregation into amyloid species in a PrP construction containing residues 121–231; King et al. (2007) identified single-stranded DNA thioaptamers (thiophosphate modified aptamers) capable of binding Syrian hamster PrP domain 90–231. However, DNAbinding by rPrP also caused conformational changes in the N-terminal domain (Lima et al. 2006). More recently, we showed that different small dsDNA sequences bind to rPrP, and the resulting rPrP:DNA complexes aggregate into supramolecular structures that lack the classical amyloid fibril morphology (Macedo et al. 2012). The

GC content of the DNA molecule seems to be important for binding, affinity, stability, aggregation patterns and toxic species generation. Various dsDNA sequences were able to induce different changes in rPrP tertiary structure, as observed by a fluorescence-quenching assay (Macedo et al. 2012). Aside from its base content, the DNA secondary structure also seems to contribute to PrP–DNA complex formation, as well as the physical and chemical characteristics of the complex. quadruplex NA structures (Fig. 2) in both DNA and RNA are able to recognize and bind to different PrP forms with high affinity (at the nanomolar range) (Cavaliere et al. 2013; Mashima et al. 2013). This interaction induces a loss of secondary structure content in both PrP and the NA molecule (Gomes et al. 2008a; Macedo et al. 2012; Cavaliere et al. 2013), indicating that there is a reciprocal conformational change upon PrP binding to NA. Interactions between PrP and RNA have been frequently reported in the past few years. RNA molecules can trigger PrP aggregation and conversion into a proteinase K (PK)-resistant isoform (PrPres) in vitro, depending on the RNA source (Adler et al. 2003; Deleault et al. 2003; Liu et al. 2007; Gomes et al. 2008a). Single-stranded RNA (ssRNA) molecules isolated from hamster brains were reported as necessary to produce PrPres (the misfolded form of PrP resistant to PK digestion) in a cell-free conversion assay in the presence of scrapie brain homogenates used as seed (Deleault et al. 2003). Other groups have reported that highly structured RNA molecules could participate in prion conversion in vitro, generating PKresistant species (Adler et al. 2003). Using a spectroscopic approach, we demonstrated that murine rPrP aggregates in vitro when incubated with RNA molecules. This interaction depends on the RNA source (bacteria, yeast, and mammalian cells) and can trigger aggregation with different intensities as observed by light scattering measurements (Gomes et al. 2008a). The efficiency of rPrP conversion induced by different sources of RNA was also observed using the PMCA technique (Deleault et al. 2003). RNA interactions can also change PrP morphology as observed by transmission electron microscopy (TEM) (Gomes et al. 2008a). Aggregated PrP species were induced by incubation with RNA. The ordered aggregates formed do not present classical amyloid fibril characteristics. Changes in both the RNA and PrP secondary structure were observed by circular dichroism (Gomes et al. 2008a). Fluorescence anisotropy experiments suggested direct RNA binding by PrP, mediated by the N-terminal flexible region, most likely between residues 51 and 90 (Fig. 4) (Gomes et al. 2008a). NMR spectroscopy measurements suggested that the N-terminal region of PrP (which is highly disordered and essential to RNA binding) loses its flexibility in the presence of RNA. Another interesting observation is that the aggregated form protects both rPrP and RNA from PK and RNase A digestion, respectively (Gomes et al. 2008a). Finally, rPrP–RNA

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2008a; Cavaliere et al. 2013), but a specific binding sequence for this interaction has not been revealed to date, suggesting a non-specific affinity for RNA, which is characteristic of an RNA chaperone (Gomes et al. 2012). It has also been reported that cytoplasmic PrP can induce the formation of a large ribonucleoprotein particle that could be involved in posttranscriptional gene regulation (Beaudoin et al. 2009). Some groups have reported that RNA aptamers (nucleic acids isolated in vitro for their ability to bind a molecule of interest) selected against specific PrP isoforms have diagnostic and therapeutic potential (Rhie et al. 2003; Sayer et al. 2004). Recently, NMR measurements showed that a 12-mer RNA aptamer forms a quadruplex structure capable of binding PrP peptides from the PrP N-terminal region and blocks PrP structural conversion (Mashima et al. 2009, 2013) (Fig. 5). Interestingly, binding of low molecular weight heparin (LMWHep) to recombinant murine PrP does not lead to PrP conversion and prevents aggregation induced by RNA (Vieira et al. 2011).

Fig. 4 RNA binding to rPrP as observed by fluorescence anisotropy. a N2aRNA binds rPrP23–231 with high affinity. N2aRNA was titrated into a 1.15 μg/ml (50 nM) FITC-rPrP23–231 solution. b The amino-terminal region is essential to RNA binding with rPrP. opRNA was titrated into 50 nM FITC-labeled rPrP23–231 (black), rPrPΔ51–90 (red), or rPrPΔ32– 121 (blue). Excitation was set at 490 nm in (a) and (b). Modified from Gomes et al. (2008a)

aggregates are highly toxic to cultured neuroblastoma (N2a) cells when the RNA extracted from N2a cells is used to produce the aggregates. RNA or rPrP alone were not able to induce toxicity (Gomes et al. 2008a). Other groups have also observed toxic species formation resulting from PrP–RNA interactions. Liu et al. (2007) characterized an ovine rPrP– RNA complex by circular dichroism (CD) spectroscopy, revealing high β-sheet content, and the same group reported the neurotoxicity of this complex (Liu et al. 2011). As observed with DNA, RNA binding to PrP also alters both protein and RNA secondary structures (Gomes et al.

Fig. 5 Structural information on the interaction between bovine PrP and an RNA aptamer. Overall organization of the complex between bovine PrP with a 12-mer RNA aptamer (R12) from NMR data obtained with Nterminal PrP peptides (P1 residues 25–35; P16 residues 108–119). PrP Lys and R12 guanosine residues involved in electrostatic interactions are shown in orange. Trp and guanosine residues involved in stacking interactions are shown in blue. The C-terminal domain of bovine PrP was drawn from PBD file 1DX0. Figure reproduced with permission (license number: 3197641505803) from Mashima et al. (2013)

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Based on the data discussed above, we propose that NAs are likely to be involved in the pathology of prion diseases. PrP binds directly to DNA and RNA, and this interaction induces PrP oligomerization/aggregation. Spectroscopic studies indicate that these interactions are different for each kind of NA: DNA-binding mediated mainly by the C-terminal globular domain produces small oligomers; and RNA-binding mediated by the unstructured N-terminal domain can produce both small oligomers and large aggregates (Fig. 6) (Gomes et al. 2008b). The NA-binding capacity of PrP can also be used as a tool to investigate the misfolding/aggregation process and to develop diagnostic methodologies and therapies. Aβ peptide Alzheimer’s disease (AD) is the most studied PMD because of its dramatically increased prevalence in the elderly. AD is the sixth-leading cause of death in the United States, and it is estimated that one in eight older Americans has Alzheimer’s disease, which is invariably fatal (Alzheimer’s Association, 2012). Post-mortem analysis of the brain of diseased patients has revealed two different types of aberrant protein

Fig. 6 Schematic representation of NA effects on rPrP misfolding/aggregation. Interaction with DNA molecules (left) leads to the formation of small toxic oligomers; interaction with RNA molecules (right) can generate large toxic aggregates or small non-toxic oligomers depending on the RNA source. Modified from Gomes et al. (2008b)

aggregates, namely the extracellular senile plaques, mainly composed of aggregated Aβ peptide, and the intracellular neurofibrillar tangles of the tau protein (Grundke-Iqbal et al. 1986; Selkoe 1997). Aβ peptide is found in two different forms comprised of either 40 (Aβ 1-40) or 42 (Aβ1-42) amino acid residues. These peptides result from the cleavage of the integral membrane protein amyloid-beta precursor protein (APP), which is expressed in different tissues but is concentrated in neuronal synapses (Citron et al. 1996). Aβ 1-40 is the most abundant peptide in amyloid plaques, but it has a slower aggregation rate than Aβ1-42 (Harper and Lansbury 1997). Tau protein is a microtubule-stabilizing protein mostly expressed in neurons, and it participates in tubulin assembly and cytoskeleton formation (Weingarten et al. 1975; Binder et al. 1985). Either extracellular deposition of Aβ or intracellular accumulation of tau protein can lead to synaptic dysfunction, neuronal death, and clinical dementia (Cummings 2004). However, genetic and biochemical evidence indicates that Aβ production is the central event in AD pathogenesis. Although still under discussion, it is becoming increasingly evident that the soluble Aβ oligomers are the main AD toxic species (Lambert et al. 1998; Bayer et al. 2001; De Felice et al. 2004). These oligomeric species might diffuse easily through the brain parenchyma and alter synaptic structure and function, ultimately leading to neuronal death (Haass and Selkoe 2007). Both nuclear and cytoplasmic localization of the Aβ peptide were reported by Johnstone et al. (1995). This finding might explain the occurrence of Aβ-dependent toxicity before significant extracellular deposition of aggregated peptides. Some reports have identified the presence of Aβ aggregates in different cellular compartments, including the nucleus (Buckig et al. 2002; Hegde et al. 2003; Ohyagi et al. 2005). The earliest observation that short nucleotides bind to senile plaques and cerebral vessels in AD was reported in 1991. The authors suggested that Aβ could bind extra chromosomal oligonucleotides in continuous cell destruction situations (Syrjanen et al. 1991). In fact, Aβ peptides can interact with DNA in vitro, as demonstrated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) (Ahn et al. 2000), and ex vivo, in which soluble Aβ aggregates were found in the nucleus of AD brain samples (Yu et al. 2007; Barrantes et al. 2007). In an interesting study, Camero et al. (2013b) used surface plasmon resonance (SPR) studies to show that amyloid fibrils formed by Aβ(25-35), a highly cytotoxic amyloid peptide, and Aβ(1-40) strongly interact with DNA (similar to DNA-histones interactions), in contrast to other non-amyloidogenic aggregated proteins, such as albumin, myoglobin, casein, and βlactoglobulin (Camero et al. 2013b). Additionally, a scrambled sequence of Aβ(25-35) abolished protein susceptibility to aggregation, neurotoxicity, and DNA-binding (Barrantes et al. 2012). One must conclude that a tendency to aggregate, which is inherent in the primary sequence of amyloid

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peptides, is crucial for DNA binding and toxicity. Moreover, these amyloid structures display greater affinity for DNA molecules than for other polyanions, such as heparin and polyglutamic acid (Camero et al. 2013a). Similar results were also described for the Aβ1-42 form (Barrantes et al. 2007). Because Aβ monomers are negatively charged at neutral pH, the driving force for Aβ binding to DNA cannot be explained by non-specific electrostatic interactions with the DNA phosphate backbone but rather by particular DNA characteristics, such as the sequence and conformation. This idea has already been underlined by two recent reports demonstrating that amyloid–DNA interactions were dependent on the DNA sequence (Yu et al. 2007; Maloney and Lahiri 2011). The DNA conformation changed in the presence of Aβ, and Aβ induced DNA condensation in a time-dependent manner (Yu et al. 2007). The Aβ–DNA interaction was shown to be dependent on the DNA sequence, as indicated by EMSA (Maloney and Lahiri 2011). A G-rich decamer was proposed as a consensus matrix for Aβ–DNA interactions. The single-base substitution G↔A on the DNA sequence diminishes the peptideinteraction, and most double-stranded oligonucleotides that were tested did not display significant interactions with Aβ as indicated by EMSA (Maloney and Lahiri 2011). It is believed that Aβ initiates the aggregation process when segments of its backbone, particularly its N–H groups and C=O groups, are exposed (Eisenberg and Jucker 2012). This conformational change would allow the peptide to form hydrogen bonds with DNA. Altogether, these results suggest that when Aβ translocates to the nucleus (Johnstone et al. 1996) and cross-talks with DNA, the protein remains inside the nucleus because of its tendency to aggregate. This localization might be an important factor responsible for altering gene expression and regulation, leading to neuronal toxicity that could contribute to the onset of AD. There are very few data available about the interactions between Aβ and RNA molecules. The first evidence of this event was provided by a Korean group in 2000. They found that both monomers and oligomers formed by Aβ1-40 and Aβ25-35 could shift RNA mobility in agarose gels, suggesting a high affinity interaction. This explanation could be caused by the capacity of a single RNA molecule to interact with more than one Aβ molecule, forming high molecular weight species or inducing Aβ aggregation that would retain the bound RNA (Ahn et al. 2000). It has also been reported that RNA can inhibit Aβ oligomerization. Using the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) tool to obtain NA aptamers that can bind a broad range of target molecules with high affinities, Takahashi et al. (2009) were able to select two RNA aptamers against Aβ1-40 that blocked Aβ fibrillation. Based on these findings, RNA aptamers could be used as a diagnostic tool to identify Aβ oligomers to establish an early diagnostic strategy or, in a more ambitious goal, to develop a

therapy to prevent the formation of toxic Aβ oligomers. In both cases, these proposals require further studies. Tau protein In addition to its participation in AD, tau protein is also involved in other neurodegenerative disorders, named tauopathies, in which tau aggregates are present. Tau was identified as a core protein in the neurofibrillary tangles (NFTs), also referred to as the paired helical filament (PHF) of AD, which constitutes the most characteristic cytoskeleton alteration in affected neurons (Grundke-Iqbal et al. 1986). There are six brain tau isoforms that are expressed from a single gene by alternative mRNA splicing, each of which is full-length and hyperphosphorylated (Goedert et al. 2006). This protein was found in the isolated nuclei of human brains and was covalently cross-linked to DNA (Brady et al. 1995; Greenwood and Johnson 1995). In fact, multiple isoforms can bind the nucleolus of cells in the interphase and the nucleolar organizing regions (NORs) of acrocentric chromosomes from cultured human neuronal cells (Thurston et al. 1996). Tau interactions with DNA were investigated using EMSA. Tau was found to bind to dsDNA but not to ssDNA (Hua and He 2003). Tau protein was able to improve DNA annealing and prevent dsDNA thermal denaturation, thereby stabilizing the DNA structure (Hua and He 2003). DNA conformational changes induced by tau were also observed by atomic force microscopy (Qu et al. 2004). Tau was recently shown to protect DNA from peroxidation damage, and it binds preferentially to oligonucleotides ≥13 bp in length, with significant affinity-loss for interactions with shorter dsDNAs. The use of specific minor and major groove ligands revealed that tau binds the minor groove of the DNA double helix (Wei et al. 2008). The association seems to occur with no apparent sequence-specificity because previous studies showed that tau binds different DNA sequences of eukaryotic (bovine thymus) or prokaryotic (plasmid) origins (Hua and He 2003). In fact, some DNA-associated proteins, such as the histones H2b and H3, interact with the minor groove of the DNA helix without nucleotide sequence specificity (Adams and Kamakaka 1999; Rohs et al. 2010). Molecular analysis revealed that tau hyper-phosphorylation might be one of the most important events in the process leading to its aggregation (Buee et al. 2000). In fact, even when phosphorylated by neuronal cdc2-like kinase, tau maintains its capacity to associate with DNA (plasmid or polynucleotide), as shown by EMSA, and increases the melting temperature of calf thymus DNA (Hua and He 2002). However, when tau was aggregated, neither native tau nor phosphorylated tau interacted with DNA (Hua and He 2002). It was recently shown that tau binds with conformation and sequence specificity to polyGC DNA oligonucleotides (CGCGCGCG)2, which form the major component sequences of promoter regions involved in gene expression

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(Antequera 2003). The interaction again increases DNA thermal stability and alters its structure as revealed by circular dichroism (CD) spectroscopy, where a shift in the positive peak from 280 to 275 nm and a reduced intensity of the negative peaks at 235 and 210 nm characterize an altered B-DNA conformation (Vasudevaraju et al. 2012). The B-DNA form is predominant in normal brains, and altered conformational changes have been reported in the genomic DNA of both moderate and severe ADaffected brains (Suram et al. 2002). In summary, tau-DNA binding stabilizes the DNA structure and leads to nucleosome rearrangements along chromatin fibers, suggesting that tau carries a DNA chaperone activity that would participate in neuronal cell dysfunction in AD. Regarding RNA interactions with tau protein, it has been reported that tau aggregation is largely enhanced by RNA molecules in vitro (Kampers et al. 1996). As with PrP (Silva et al. 2008), tau interactions with RNA may lower the energy barrier between non-aggregated and aggregated isoforms (Fig. 3). α-synuclein Alpha-synuclein (α-syn) is a small intracellular protein that localizes in the nucleus and presynaptic nerves and is centrally implicated in Parkinson’s disease (PD) (Maroteaux et al. 1988; Goedert 2001). It is estimated that PD afflicts approximately 1 % of Americans older than 60 years of age and 45 % of individuals older than 85 years of age (Alkhuja 2013). Although the etiology of PD is not yet fully understood, it can be caused by familial and sporadic factors, with prevalent sporadic forms (∼90 % of PD cases). Genetic information on the familial forms and immunohistochemical analysis led to the identification of α-syn protein deposition. Aggregates of α-syn found in the cytosol of dopaminergic cells constitute the major component of Lewy bodies (cytoplasmic inclusion bodies) and Lewy neurites (dystrophic neurites) associated with the synucleinopathies, a neuropathology of progressive dementia and neuronal loss in the substantia nigra of the brain (Bisaglia et al. 2009). Movement disability and general motor dysfunction are the most common clinical signs of this disease. The correlation between protein inclusion formation and neurotoxicity is still not consistent, as discussed for other PMDs. Biochemical studies and high-resolution microscopic techniques suggest that soluble oligomers may be the primary culprit in PD neurodegeneration (Kalia et al. 2013). Many structural studies have revealed that α-syn has a native unfolded tertiary structure, like tau protein, although it was shown that α-syn may adopt a helical tetrameric form in the brain and red blood cells (Wang et al. 2011; Bartels et al. 2011). Little information about the exact mechanism of its accumulation and fibrillization in the cell is available. The kinetics of α-syn oligomer formation and morphology coincide with those observed in vitro for Aβ oligomers, indicating

a common aggregation process (Harper et al. 1997). The physiological role of α-syn is poorly understood, but it may protect neurons from injuries and maintain synaptic function (Kaplan et al. 2003; Chandra et al. 2005), promoting the assembly of the SNARE machinery (Thayanidhi et al. 2010) as well as neurotransmitter release (Bartels et al. 2011). Several factors, such as metals, oxidative stress, protein degradation, and mutations, as well as processes such as phosphorylation, glycation, and DNA-binding, are linked to the αsyn aggregation process (Vasudevaraju et al. 2012). The structural flexibility of α-syn, as well as other intrinsically unfolded proteins (IUP), increases their binding power to other macromolecules; therefore, many different ligands can modulate α-syn transition to an aggregated state upon binding, which normally accelerates the reaction. Glycosaminoglycans, polyamines, metal cations, fatty acids, anionic detergents, and nucleic acids are the most common examples (Cohlberg et al. 2002; Antony et al. 2003; Necula et al. 2003; Cherny et al. 2004). Nuclear localization of α-syn allows it to interact with histones, forming a stable and tight complex (stoichiometry of 2:1 α-syn to histones) that stimulates α-syn fibrillation in vitro (Goers et al. 2003). The authors observed that the intensity of the effect depends on the nature of the polymer, its length, and concentration. In fact, Cherny et al. (2004) first reported α-syn interactions with another chromatin component, dsDNA (linear or supercoiled). DNA association with either wild-type α-syn or two disease-related mutants (A30P and A53T) stimulate α-syn assembly into mature fibrils. Electron microscopy and electrophoresis clearly demonstrate α-syn–DNA complex formation, protecting DNA from endonuclease digestion (Cherny et al. 2004). Similarly, it was shown that different DNAs induced different conformational changes in α-syn (Hegde and Rao 2007). Circular ssDNA induced gain in alpha helices for α-syn and greatly delayed its fibrillation, whereas smaller oligonucleotides (8-mer) and linear dsDNA, both rich in GC content, induced partial α-syn folding, which then becomes prone to aggregation. In contrast, polyAT dsDNA could bind α-syn but did not cause conformational transition or modulate protein aggregation, thereby indicating a particular DNA-binding effect on the α-syn fibrillation pathway (Hegde and Rao 2007). From the above considerations, we can conclude that nuclear-translocated α-syn can interact with histone-free, transcriptionally active DNA segments and, hence, may alter gene expression regulation. Moreover, this interaction may modulate α-syn folding with relevant implications for its biological function and disease progression. Huntingtin Huntington’s disease (HD) belongs to a family of neurodegenerative hereditary diseases caused by mutations that expand a CAG repeat tract in DNA, leading to abnormal

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repetitions of glutamine residues (polyQ) in the encoded protein (Sugars and Rubinsztein 2003); thus, HD is also known as a polyglutamine disease. HD is caused by a CAG tract with more than 35 repeats in exon 1 of the gene encoding a protein called huntingtin (htt) (The Huntington’s Disease Collaboration Research Group 1993). This disease is characterized by a significant loss of brain mass associated with a decrease in motor ability, dementia and emotional changes, culminating in death approximately 20 years following disease onset (The Huntington’s Disease Collaboration Research Group 1993). Wild-type htt, a protein with an estimated molecular mass of 350 kDa, is mainly localized in the cytoplasm of neurons, although it has been found in other subcellular compartments, including the nucleus (Ho et al. 2001; Kegel et al. 2002). The polyQ expansion in htt influences the localization and frequency of intraneuronal aggregates of mutant htt in vitro and in vivo (Martindale et al. 1998). The primary hypothesis suggests that neurotoxicity arises from the cleavage and accumulation of the N-terminal fragments containing the polyQ tract, but the relevance of this expansion to HD pathogenesis is still under debate (Dyer and McMurray 2001; Sugars and Rubinsztein 2003). In fact, htt cleavage promotes nuclear localization, with the polyQ length influencing the extent of its accumulation (DiFiglia et al. 1997). Although wild-type htt can be found in the nucleus, the polyQ-expanded htt displays a higher frequency of nuclear localization than the non-expanded protein (Dorsman et al. 1999; Kegel et al. 2002). In the nucleus, this mutant might bind several cellular transcription factors and is highly detrimental in vitro and in vivo (Kegel et al. 2002; Schilling et al. 2004; Benn et al. 2005). Kegel et al. (2002) have shown that the polyQ N-terminal fragments of htt can repress transcription only when targeted to DNA by interfering directly in the transcription machinery rather than by sequestering essential transcription components into htt aggregates (Kegel et al. 2002). This evidence is in agreement with Steffan et al.

(2000), who suggested that transcriptional repression may occur regardless of aggregate formation. It was also shown that p231HBP/HYPB, a protein that interacts with the Nterminus of htt, is a DNA-binding factor, further suggesting that huntingtin is in close proximity to DNA in situ (Rega et al. 2001). More recently, it was reported that either the wild-type or the mutant htt can interact directly with DNA in the absence of other proteins, and they can differentially alter DNA conformation (Benn et al. 2008). It was also shown that polyQ expansions increase htt–DNA interactions as estimated by DNA immunoprecipitation using htt-specific antibodies. Moreover, many transcription factor activities were affected in response to mutant htt (Benn et al. 2008). In summary, these findings suggest several roles for htt in the nucleus that can be affected by the polyQ tract. The abnormal interaction of mutant htt with DNA could alter the DNA conformation, leading to a transcriptional deregulation that seems to be the central pathogenic mechanism in HD (reviewed in Luthi-Carter and Cha 2003).

Final considerations Throughout this review, we discussed the role of proteinnucleic acid interactions for a set of proteins involved in human degenerative diseases. In summary, aberrant nucleic acid-protein interactions may result in protein aggregation and the formation of toxic species depending on the nucleic acid sequence and/or conformation, leading to reciprocal structural changes. The main effects observed upon nucleic acid binding by PrP, tau, Aβ, α-syn, and huntingtin are summarized in Table 2. There is a substantial amount of information regarding abnormal interactions of prion proteins, tau, α-syn, and Aβ with DNA molecules. Such interactions lead to increased βsheet contents for these proteins, and, in some cases, it has

Table 2 Proteins involved in PMDs, and their interactions with RNA and/or DNA molecules Protein DNA Effect

Refs.

PrP

+

Aggregation inhibition or induction; conversion into β-sheet-rich species that may be cytotoxic.

Cordeiro et al. 2001; King + et al. 2007; Macedo et al. 2012; Cavaliere et al. 2013

tau

+

Binding stabilizes the dsDNA molecule.

Aβ

+

α-syn

+

Htt

+

Vasudevaraju et al. 2012; Hua and He 2003; Qu et al. 2004 Aβ fibrils bind DNA; interactions Yu et al. 2007; Maloney alter DNA conformation. and Lahiri 2011; Camero et al. 2013b Induction of α-syn assembly Cherny et al. 2004; into mature fibrils; folding Hegde and Rao 2007 of α-syn. Alters DNA conformation. Benn et al. 2008

RNA Effect

+

Refs.

Aggregation inhibition or Deleault et al. 2003; induction; conversion into Gomes et al. 2008a, β-sheet-rich species; b; Mashima et al. 2009 generation of cytotoxic species. Aggregation is enhanced in vitro Kampers et al. 1996 by RNA molecules.

+

Modulation of peptide aggregation.

-

Not reported.

-

Not reported.

Ahn et al. 2000; Takahashi et al. 2009

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been reported that a dual conformational change takes place, which also affects the DNA molecule. It remains to be established whether protein––DNA binding depends on protein translocation to the nucleus or whether exogenous DNA participates in binding and further structural conversion. The specificity of such interactions is still under debate, but recent data support the idea that both DNA and the target protein conformation are relevant for this process. We should also remark that all of these neurodegenerative diseases lead to cell death and the release of nucleic acids, which can cause further protein–nucleic acid interactions and subsequent aggregation, likely perpetuating a prion-like effect. In the case of RNA molecules, it is evident that protein– RNA interactions frequently occur inside the cell. For most RNA molecules to perform their cellular functions, they must first bind to a protein. RNA secondary structure is usually important for this phenomenon to occur (Nagai 1996). In proteins, there are two main types of domains that are able to recognize RNA molecules; in the first domain, RNA binding occurs through an alpha-helix or loop; in the second, some amino acids involved in a β-sheet structure interact with unpaired RNA bases (Draper and Reynaldo 1999). Therefore, it is expected that the protein that binds the RNA maintains at least part of its secondary structure. It has also been hypothesized that PrP, for instance, is involved in RNA metabolism. PrP can interact with RNA from HIV and form structures similar to those obtained with capsidic retroviral proteins (Gabus et al. 2001). Additionally, PrP is thought to act as an RNA chaperone (Gabus et al. 2001; Ivanyi-Nagy et al. 2005; Silva et al. 2008) because nucleic acid chaperone activity is based on specific and non-specific NA recognition and binding. These proteins play an important role in DNA and RNA processing and are important to RNA translation and transport (Gomes et al. 2012). Acknowledgments The laboratory work of Y.C. and J.L.S. was supported by grants from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifíco e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) of Brazil. Conflict of interest Authors Yraima Cordeiro, Bruno Macedo, Jerson L. Silva and Mariana P. B. Gomes declare that they have no conflict of interest. Human and Animal Studies This article does not contain any studies with human or animal subjects performed by the any of the authors.

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J Biol Inorg Chem (2014) 19:839–851 DOI 10.1007/s00775-014-1115-8

ORIGINAL PAPER

Biophysical and morphological studies on the dual interaction of non-octarepeat prion protein peptides with copper and nucleic acids Juliana A. P. Chaves • Carolina Sanchez-Lo´pez • Mariana P. B. Gomes • Tha´yna Sisnande • Bruno Macedo • Vanessa End de Oliveira • Carolina A. C. Braga Luciana P. Rangel • Jerson L. Silva • Liliana Quintanar • Yraima Cordeiro

•

Received: 16 November 2013 / Accepted: 28 January 2014 / Published online: 21 February 2014 Ó SBIC 2014

Abstract Conversion of prion protein (PrP) to an altered conformer, the scrapie PrP (PrPSc), is a critical step in the development of transmissible spongiform encephalopathies. Both Cu(II) and nucleic acid molecules have been implicated in this conversion. Full-length PrP can bind up to six copper ions; four Cu(II) binding sites are located in the octarepeat domain (residues 60–91), and His-96 and His-111 coordinate two additional copper ions. Experimental evidence shows that PrP binds different molecules, resulting in diverse cellular signaling events. However, there is little information

Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1007/s00775-014-1115-8) contains supplementary material, which is available to authorized users. J. A. P. Chaves  M. P. B. Gomes  T. Sisnande  B. Macedo  Y. Cordeiro (&) Faculdade de Farma´cia, Centro de Cieˆncias da Sau´de, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Carlos Chagas Filho 373, Bloco B, Subsolo, Sala 17, Rio de Janeiro, RJ 21941-902, Brazil e-mail: [email protected] C. Sanchez-Lo´pez  L. Quintanar Departamento de Quı´mica, Centro de Investigacio´n y de Estudios Avanzados, 07360 Mexico, D.F., Mexico V. E. de Oliveira Instituto de Cieˆncia e Tecnologia, Universidade Federal Fluminense, Campus Universita´rio de Rio das Ostras, Rio das Ostras, RJ 28890-000, Brazil C. A. C. Braga  L. P. Rangel  J. L. Silva Instituto de Bioquı´mica Me´dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil J. L. Silva  Y. Cordeiro Instituto Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro 21941-590, RJ, Brazil

about the interaction of macromolecular ligands with Cu(II)bound PrP. Both RNA and DNA sequences can bind PrP, and this interaction results in reciprocal conformational changes. Here, we investigated the interaction of Cu(II) and nucleic acids with amyloidogenic non-octarepeat PrP peptide models (comprising human PrP residues 106–126 and hamster PrP residues 109–149) that retain His-111 as the copperanchoring residue. The effect of Cu(II) and DNA or RNA sequences in the aggregation, conformation, and toxicity of PrP domains was investigated at low and neutral pH. Circular dichroism and EPR spectroscopy data indicate that interaction of the PrP peptides with Cu(II) and DNA occurs at pH 7. This dual interaction induces conformational changes in the peptides, modulating their aggregation, and affecting the morphology of the aggregated species, resulting in different cytotoxic effects. These results provide new insights into the role of Cu(II) and nucleic acid sequences in the structural conversion and aggregation of PrP, which are both critical events related to prion pathogenesis. Keywords Copper  Prion protein  Nucleic acid  EPR  Toxicity  Spectroscopy Abbreviations CD Circular dichroism dsDNA Double-stranded DNA EPR Electron paramagnetic resonance LS Light scattering MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid PBS Phosphate-buffered saline PrP Prion protein C PrP Cellular prion protein PrPSc Scrapie prion protein rPrP Recombinant prion protein TEM Transmission electron microscopy

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Introduction A misfolded form of the prion protein (PrP), the scrapie PrP (PrPSc), is implicated in the occurrence of the neurodegenerative diseases called transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Although the cellular PrP (PrPC) is innocuous to animals, PrPSc is infectious and is found aggregated in the central nervous system [1]. A specific function has not been yet attributed to PrPC, but it may participate in neuronal development, cell adhesion, apoptotic events, and cellular signaling in the central nervous system [2]. Most importantly, PrP binds copper ions in vivo [3, 4], and it is proposed that this protein regulates copper homeostasis [5, 6]. Mature PrP has a flexible N-terminal domain (residues 23–125) and a globular C-terminal domain (residues 128–231) [7]. Spectroscopic studies have revealed that PrP has six copper binding sites in its N-terminal region [6]. Four copper binding sites are located in the octarepeat domain (comprising residues 60–91 of the fulllength PrP) [4, 6], and two histidine residues outside the octarepeat, His-96 and His-111, are the anchoring residues for two additional copper ions [8–10]. Although much is known about the copper-binding properties of PrP, there is little information about the interaction of copper with PrP when the protein is bound to other cellular ligands. Several macromolecular ligands have been described to bind PrP and trigger both its aggregation and its conversion into b-sheet-rich species; these ligands include nucleic acid molecules, both DNA and RNA sequences [11–16]. Moreover, binding of nucleic acids by PrP results in conformational changes in either the protein or the nucleic acid molecule, or both [16, 17]. Abnormal protein interactions with nucleic acids have also been described in other neurodegenerative diseases. The knowledge that PrP binds copper ions in vivo [3] raises the question of how interactions with nucleic acids occur with copper-loaded PrP. The present work aims to evaluate the effects of copper and nucleic acid sequences in the aggregation profile, conformation, and cytotoxicity of non-octarepeat PrP domains at low and neutral pH. It is well known that both ligands independently interact with PrP [6, 18, 19]; however, evaluation of binding of nucleic acids to copperloaded PrP and vice versa has not been reported. We investigated the interaction of Cu(II) with two peptides corresponding to the non-octarepeat PrP regions, human PrP106–126 and hamster PrP109–149, comprising residues 106–126 and 109–149 of mammalian PrPs, respectively. These peptides were chosen as models, as they aggregate at different pH values, possess only one copper binding site, and have been reported to bind nucleic acids. Therefore, they are simpler models (in comparison with full-length

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PrP) to initially investigate the interaction of PrP with two different ligands (copper and nucleic acids). PrP106–126 aggregates at neutral pH, and it is highly neurotoxic in its aggregated form [20, 21]. Aggregation of PrP106–126 can be modulated by divalent cations such as copper and zinc ions, and His-111 might participate in these interactions [22–25]. PrP109–149 encompasses a loop and part of the first a-helix of the native full-length PrP [26, 27], and it immediately aggregates when diluted in aqueous solution at low pH, which makes it a good model for screening antiaggregating compounds [12, 28, 29]. Both PrP peptides bind DNA molecules with high affinity. Whereas PrP106–126 forms amyloid-like structures when bound to plasmid or synthetic double-stranded DNA (dsDNA) [30, 31], small dsDNA molecules inhibit aggregation of PrP109–149 at pH 5.0 [12]. We have characterized copper binding by these peptides at a range of pH values using spectroscopic techniques, including electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, circular dichroism (CD) spectroscopy, and light scattering (LS) measurements. We selected oligonucleotide sequences (DNA and RNA) previously characterized by our group as ligands of either recombinant full-length PrP or PrP109–149 [12, 32–34] to provide further insight into how the structural conversion mediated by nucleic acids occurs in a copper-bound form of the protein. Aggregation and conformational changes of PrP109–149 and PrP106–126 were monitored in the presence of both ligands, copper and nucleic acids, by spectroscopic techniques and microscopy. Additionally, cell viability assays provided information regarding the effect of nucleic acids and Cu(II) on PrP106–126 cytotoxicity toward mammalian cells, since this peptide is highly neurotoxic when aggregated at neutral pH [20].

Materials and methods Materials All reagents were of analytical grade and were acquired from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) unless otherwise specified. Oligonucleotides were purchased as single strands from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) and were annealed under high-stringency conditions [10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer, 250 mM NaCl, pH 7.2]. Annealing was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis. The following sequences were investigated (only 50 –30 consensus strands are shown): D44 (50 -GTA ACC GAA ATC GGT TGA-30 ) and D67 (50 -AAA GGA CGC GCG CGC GCG TTA-30 ). R67 is the single-stranded RNA sequence corresponding to D67 [34]. Spectroscopic characterization of Cu(II) binding

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to annealed DNA was performed at 0.2 mM concentration in 5 mM N-ethylmorpholine buffer containing 250 mM NaCl.

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100 kHz; time constant, 327 ms; conversion time, 82 ms; and averaging over six scans. EPR spectra were recorded at 150 K using an ER4131VT variable-temperature nitrogen system.

Peptides Light scattering measurements The PrP106–126 peptide, with sequence 106-KTNMKHMA GAAAAGAVVGGLG-126, (theoretical pI, 10.0; molecular mass, 1,912.2 Da; hydrophobicity, 52 %) was synthesized in the solid phase using 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chemistry, and was purified by reversed-phase highperformance liquid chromatography to greater than 90 % purity. The PrP109–149 peptide, with sequence 109-MKHMAGAAAAGAVVGGLGGWMLGSAMSRPM MHFGNDWEDRY-149 (theoretical pI, 6.7; molecular mass, 4,326 Da; hydrophobicity, 51 %), was synthesized in the solid phase, and was purified by reversed-phase highperformance liquid chromatography by GeneMed Synthesis (San Antonio, TX, USA) to greater than 90 % purity. Both peptides were N-acetylated and C-amidated to prevent nonspecific coordination to Cu(II). Alignment of residues 106–149 (comprising both peptides studied here) from mouse, hamster, and human PrP evidences the high homology found in this region (Fig. S1). Stock solutions of PrP106–126 were prepared at 1 mM in 100 % dimethyl sulfoxide. For spectroscopic measurements, PrP106–126 was diluted in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 to a final concentration of 20 lM. For the aggregation measurements, PrP109–149 was diluted from an unfolded condition (in 6 M urea containing 10 mM sodium dodecyl sulfate) in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer at pH 5.0 without denaturants. For investigation of Cu(II) binding to the peptides by CD and EPR spectroscopy, PrP109–149 was dissolved at 0.2 mM in 6 M urea and PrP106–126 was dissolved at 0.3 mM in 10 mM N-ethylmorpholine buffer containing 100 mM NaCl. Circular dichroism spectroscopy CD spectra were collected using a J-815 spectropolarimeter (JASCO, Tokyo, Japan). Spectra were collected with adequate subtraction of the baseline spectrum with three scans each. CD spectra were collected from 230 to 830 nm using a quartz cuvette with 1-cm path length to study metal ion binding. Electron paramagnetic resonance spectroscopy X-band EPR spectra were collected using a Bruker EMX Plus system with an ER 041 XG microwave bridge and an ER 4102ST cavity. The following conditions were used: microwave frequency, 9.4 GHz; microwave power, 10 mW; modulation amplitude, 5 G; modulation frequency,

Static LS was recorded with an FP6300 spectrofluorimeter (JASCO, Tokyo, Japan). The LS was measured at 90° by illuminating samples at 320 nm or 450 nm and collecting the resulting scattered light either from 300 to 340 nm or from 430 to 470 nm, respectively. Turbidity assay Aggregation of unbound PrP106–126 or PrP106–126 in the presence of Cu(II) and/or D67 (molar ratios 1:1; 1:1:1) in PBS at pH 7.4 was monitored by spectrophotometry by acquiring absorbance values at 400 nm for up to 21 days. Transmission electron microscopy Samples were diluted in MES buffer (50 mM, pH 5.0) for PrP109–149 (freshly aggregated) or in PBS (pH 7.4) for PrP106–126 (aggregated for 21 days). Twenty microliters of each sample was applied to a carbon-coated copper grid, and after 5 min the grid was washed with Milli-Q water. Samples were stained with 2 % uranyl acetate, and images were collected with a JEOL (Boston, MA, USA) 1200 microscope at 80 kV. Raman spectroscopy Fourier transform Raman spectroscopy measurements were performed using a Bruker RFS 100 instrument and a neodymium-doped yttrium aluminum garnet laser, operating at 1,064 nm in the near-infrared with a charge-coupled device detector cooled with liquid nitrogen. Good signal-to-noise ratios were obtained with 1,000–2,000 total scans using a range of laser powers on the sample, from 100 to 300 mW, and a spectral resolution of 4 cm-1. To prevent peptide degradation, spectra were obtained initially at the lowest laser power in this range, an this power was then progressively increased to produce an improved spectral response. The measurements were obtained with the PrP109–149 samples at 1 mM incubated with either Cu(II) or D67 (1:1 molar ratio) in sealed DuranÒ tubes; all spectra were obtained in situ with at least two acquisitions at each sampling position, demonstrating the reproducibility and consistency of data acquisition as well as ensuring sample integrity. The signal of the buffer (10 mM MES, pH 5.0) was subtracted from the respective spectra using the GRAMSÒ spectroscopy software suite program.

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Murine neuroblastoma cell (Neuro-2a) cell viability assay Neuro-2a cell culture and the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide) reduction assay were performed as described previously [34]. Briefly, cells were incubated with free PrP106–126, DNA, or Cu(II), or with the peptide combined with DNA, Cu(II), or both (fresh samples or after 7, 14, or 21 days’ incubation). After 72 h, formazan was quantified by reading the optical density at 570 nm in a 96-well plate reader (Spectramax M5, Molecular Devices). Mean values and standard deviations were calculated from triplicates of independent experiments. Statistics Statistical analyses were performed using the programs SigmaPlot (version 10.0) or GraphPad Prism. One-way analysis of variance Tukey tests were applied to determine significant differences between the individual treatments. Unless otherwise specified, all experiments were performed in triplicate and the error bars indicate the standard error of the mean.

Results Spectroscopic investigation of Cu(II) binding to peptides PrP106–126 and PrP109–149 We initially investigated Cu(II) binding by PrP109–149, using CD and EPR spectroscopy, and compared it with the Cu(II) binding properties of PrP106–126. Titration of PrP109–149 with Cu(II) at pH 7.5 followed by CD spectroscopy clearly indicated that PrP109–149 binds Cu(II) in a 1:1 molar ratio (Fig. 1a), in a fashion similar to that of the shorter fragments PrP106–115 and PrP106–126, which do not contain His-140 [10] (Fig. S2a). However, a comparison of the CD spectra of the Cu(II) complexes with PrP109–149 and PrP106–126 at pH 7.5 reveals some differences (Fig. 1b) that can be ascribed to the fact that the two complexes display different pKa values. Cu(II) binding to His-111 in PrP106–115 and PrP106–126 is pH-dependent, with a pKa of 7.5 that is ascribed to the backbone amide of Met-109 (Fig. S2b); consequently, a mixture of two species with different coordination modes (3N1O and 4N) is observed at pH 7.5 [10]. In contrast, the CD spectrum of the Cu(II) complex with PrP109–149 shows no significant changes between pH 8.5 and 6.5 (Fig. 1c). This is because truncation of the first three amino acid residues in the N-terminal causes an increase in the pKa of the amide of Met-109 to yield a pKa of 8.9, as shown for the PrP109–112 fragment (Fig. S2c).

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Consistently, the CD spectra of the Cu(II) complexes with PrP109–149 and PrP106–126 are identical at pH 6.5 (Fig. 1d). In both spectra, ligand-to-metal charge transfer transitions can be resolved at 31,000 and 39,400 cm–1, which are indicative of amide and imidazole coordination to Cu(II) [35–37]. X-band EPR spectroscopy shows that Cu(II) bound to PrP106–126 and PrP109–149 at all pH values investigated displays gk [ g? [ 2.00 and a large parallel copper hyperfine splitting (AII), indicative of a dx2–y2 ground state (Fig. 2). Consistent with the CD data, the EPR spectra of the Cu(II)–PrP109–149 complex at pH 8.5 and 7.5 are practically identical (Fig. S3), with gk = 2.225 and Ak = 177 9 10-4 cm-1; these values fall in a range associated with a 3N1O equatorial coordination mode, according to Peisach–Blumberg correlations (Fig. S4) [38, 39]. A comparison of the EPR spectra for the Cu(II) complexes with PrP109–149 and PrP106–126 at pH 7.5 shows similar EPR signals and parameters (Table 1, Fig. 2,spectra a), with the preponderant species being a 3N1O complex; some differences are evident in the perpendicular region of the spectra, indicative of the presence of 4N species for the Cu(II)–PrP106–126 complex, as discussed above. Overall, considering the fact that PrP106–126 lacks His-140, our CD and EPR results suggest that His-111 is the anchoring Cu(II) binding site in PrP109–149, whereas His-140 does not take part in the metal ion coordination at pH 7.5. A different scenario is observed at pH 5.5, where no CD signals could be associated with the formation of a chiral Cu(II)–peptide complex for both PrP109–149 and PrP106–126 (Fig. 1d). However, the EPR spectra of these peptides in the presence of 1Eq Cu(II) at pH 5.5 display signals that are different from those for free Cu(II) in solution (Fig. 2. spectra b), indicating the formation of distinct Cu(II)–peptide complexes. The Cu(II)–PrP106–126 complex displays gk = 2.290 and Ak = 160 9 10-4 cm-1 (Fig. 2, Table 1), which fall close to the values associated with a 2N2O equatorial coordination mode (Fig. S4). In contrast, the Cu(II)–PrP109–149 complex displays gk = 2.343 and Ak = 159 9 10-4 cm-1 (Fig. 2, Table 1), indicative of a 4O equatorial coordination mode (Fig. S4). The EPR parameters associated with this species are remarkably similar to those associated with Cu(II) bound to murine PrP121–231 at low pH (3–6), where a 4O coordination environment that does not involve any histidine coordination was assigned, as determined by pulsed EPR spectroscopy [11, 40]. Thus, the low pH and oxygen-rich Cu(II) coordination mode observed in PrP109–149 could involve carboxylic acids from the C-terminal region (potentially Asp-144 and Asp-147 or Glu-146) and/or water molecules, and it does not involve histidine coordination.

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Fig. 1 Circular dichroism (CD) measurements reveal Cu(II) binding to prion protein (PrP) peptides comprising residues 106–126 (PrP106–126) and 109–149 (PrP109–149) at different pH values. a Titration of PrP109–149 with Cu(II), as followed by CD spectroscopy at pH 7.5. The CD spectra recorded after the addition of 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.4, 1.6, and 1.8 Eq of Cu(II) are displayed as dashed lines, whereas those for 1.0 and 2.0 Eq of Cu(II) are shown as solid lines. b CD spectra of Cu(II) bound to PrP106–126 at pH 7.5 (solid line), compared with the Cu(II) complex with PrP109–149 (dashed line).

c CD spectra of the Cu(II)–PrP109–149 complex with 1 Eq of Cu(II) at different pH values: 5.5 (dotted line), 6.5 (dashed line), 7.5 (dash-dotdash line), and 8.5 (solid line). d CD spectra of Cu(II) bound to PrP106–126 at pH 6.5 (solid black line) and pH 5.5 (solid gray line), compared with the Cu(II) complex with PrP109–149 at pH 6.5 (dashed black line) and pH 5.5 (dashed gray line). The insets in c and d show the energy region (14,000–22,000 cm-1) where the ligand field transitions appear

Spectroscopic investigation of Cu(II) and DNA binding to PrP106–126 and PrP109–149

Table 1). These signals are also different from those that arise from free Cu(II) in solution, strongly suggesting the formation of a Cu(II)–DNA–PrP109–149 ternary complex at pH 7.5. A similar scenario is observed on addition of PrP106–126 to Cu(II)–DNA, where a new set of signals with gk = 2.309 and Ak = 140 9 10-4 cm-1 arise (Fig. 2, spectra a, Table 1), suggesting the formation of a Cu(II)– DNA–PrP106–126 ternary complex. It should be noted, however, that residual signals associated with the Cu(II)PrP106–126 complex are also observed (Fig. 2, spectra a), revealing a lower relative stability of the Cu(II)–DNA– PrP106–126 ternary complex with respect to the Cu(II)– peptide complex. This is probably because the latter presents two species (vide supra), 3N1O and 4N, where the 4N coordination mode provides higher stability to the Cu(II)– peptide complex, and thus competes with DNA binding. Consistently, the EPR parameters associated with the residual Cu(II)–PrP106–126 complex in the Cu(II)–DNA– PrP106–126 mixture correspond to the characteristic signals of the 4N coordination mode (with gk = 2.225 and Ak = 189 9 10-4 cm-1). At pH 5.5, addition of PrP109–149 to the Cu(II)–DNA complex to reach a final 1:1:1 molar ratio also caused

We next asked if DNA-bound Cu(II) would still display peptide binding properties. We used 18-mer and 21-mer dsDNA sequences (D44 and D67), previously identified to interact with recombinant PrP (rPrP) and to induce its aggregation into cytotoxic species [12, 34]. EPR experiments showed that at pH 7.5, a Cu(II)–DNA complex is formed, with gk and Ak values that are indicative of a nitrogen-rich coordination environment (Table 1); copper– nitrogen superhyperfine interactions are evidenced by the fine structure in the perpendicular region of the spectrum (Fig. 2, spectra a). In contrast, at pH 5.5, a different Cu(II)–DNA complex is formed, with gk and Ak values that are associated with a less nitrogen-rich coordination environment, likely 4O or 1N3O (Table 1, Fig. S4). At pH 7.5, addition of PrP109–149 to the Cu(II)–DNA complex to reach a final 1:1:1 molar ratio caused drastic changes in the EPR spectrum, resulting in a new set of signals with gk = 2.299 and Ak = 156 9 10-4 cm-1 that do not correspond to those associated with the Cu(II)–DNA or Cu(II)–PrP109–149 complexes (Fig. 2, spectra a,

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Fig. 2 Cu(II) binds to PrP106–126, PrP109–149, and DNA, forming a Cu(II)–DNA–peptide ternary complex, as revealed by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. Comparison of EPR spectra of 1 Eq Cu(II) with PrP106–126, PrP109–149, DNA and

PrP106–126, DNA and PrP109–149, and DNA at pH 7.5 (a) and pH 5.5 (b). The signals associated with free Cu(II) in solution are indicated with an asterisk

Table 1 Electron paramagnetic resonance parameters for Cu(II)–DNA, Cu(II)–peptide, and ternary complexes at pH 7.5 and 5.5 pH 7.5 gk

pH 5.5 Ak

gk -4

10

cm

-1

MHz

Ak 10-4 cm-1

MHz

Cu(II)–PrP106–126

2.222

176

529

2.290

160

481

Cu(II)–PrP109–149

2.225

177

530

2.343

159

479

Cu(II)–DNA–PrP106–126 Cu(II)–DNA–PrP109–149

2.309 2.299

140 156

421 467

2.290 2.292

160 156

481 469

Cu(II)–DNA

2.241

201

603

2.335

153

458

The gk and Ak values in bold can be assigned to the ternary complexes PrP prion protein

drastic changes in the EPR spectrum, resulting in signals with gk = 2.292 and Ak = 156 9 10-4 cm-1 that can be associated with the formation of a ternary complex, as they do not correspond to those for Cu(II)–DNA or Cu(II)– peptide complexes (Fig. 2, spectra b, Table 1); a small amount of residual signals for the Cu(II)–DNA complex is also observed. In contrast, the most intense set of EPR signals in the spectrum of the Cu(II)–DNA–PrP106–126 mixture corresponds to the Cu(II)–PrP106–126 complex

123

(Fig. 2, spectra b, Table 1), whereas a small amount of the Cu(II)-DNA complex is also observed. These results clearly indicate that at low pH only PrP109–149 is capable of forming a ternary complex with Cu(II) and DNA, and there was no evidence for the formation of a ternary complex with PrP106–126. It should be noted that the EPR parameters for the Cu(II)–DNA–PrP109–149 ternary complexes at pH 5.5 and 7.5 are almost identical (Table 1) and indicative of a 2N2O

Effect of Cu(II) and DNA on the aggregation properties of PrP peptides PrP-derived peptides are alternative models to study and understand PrP aggregation [12, 29]. In the present study, we investigated aggregation of human PrP106–126 and hamster PrP109–149. Although derived from different species, the peptides share the same amino acid sequence in the region 109–126 (Fig. S1). Our EPR and CD results

100

Aggregation (%)

coordination mode according to Peisach-Blumberg correlations (Fig. S4) [38, 39]. The fact that the ternary complex at low pH could be formed with PrP109–149 and not with PrP106–126 suggests that the C-terminal region of PrP109–149 is key for the formation of the ternary complex at low pH and/or it participates in the metal coordination shell. Moreover, the hyperfine splitting Ak associated with the ternary complex with PrP106–126 at pH 7.5 is different from that of the PrP109–149 ternary complex, indicating differences in the nature of the ligands in each case, and thus suggesting that the C-terminal region of PrP109–149 may participate in the coordination of the ternary complex or contribute to its coordination properties. Fourier transform Raman spectroscopy measurements were performed in situ to provide further evidence for the formation of the Cu(II)–DNA–PrP109–149 ternary complex at pH 5.0 (Fig. S5). Raman spectra were obtained for unbound peptide and the Cu(II)–PrP109–149 complex, both before and after the addition of 1 Eq dsDNA (D67) (Fig. S5). Analysis of the Raman spectra shows that the band at approximately 1,650 cm-1, assigned to the m(CO) mode, becomes narrower (amide I) on addition of copper to PrP109–149; the same behavior is observed for the bands at 1,450 and 1,159 cm-1. This profile indicates an increased local symmetry related to a decrease in hydrogen bonding, which may be caused by copper coordination. On the addition of DNA, the band broadening is more evident, attributed to NH2 and NH deformation modes [41]. The band at 716 cm-1 was not observed after addition of Cu(II) and DNA; changes in this band are attributed to modifications in hydrogen interaction forces and the hydrophobic character derived from protein unfolding [42]. DNA backbone bands (approximately 830 and 1,093 cm-1) [42] were not observed under the conditions applied. These data suggest that a ternary complex is formed at pH 5.0 and that metal coordination is affected by changes in the PrP109–149 structure caused by the formation of a ternary complex. Altogether, these results provide strong evidence for the formation of ternary complexes of PrP109–149 and PrP106–126 with Cu(II) and DNA at neutral pH, whereas at low pH a ternary complex is only formed with PrP109–149. Further spectroscopic investigation is needed to identify the nature of the coordinating ligands in these complexes.

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Aggregation (%)

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80

60

150

100

50 1

10

100

1000

CuCl2 (nM)

40

20 0

5

10

15

20

25

30

CuCl2 (µM)

Fig. 3 Cu(II) inhibits PrP109–149 aggregation. The peptide was diluted to 3 lM in 50 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES ) buffer at pH 5.0, and the light scattering (LS) value at 450 nm was followed over time. Inset aggregation was followed in the presence of CuCl2 up to 3.0 lM. The maximum LS value obtained from each kinetic trace was corrected assuming 100 % as the LS value obtained in the absence of copper ions or urea and 0 % aggregation as the LS value obtained when the peptide was diluted in 6 M urea. Error bars indicate the standard error of the mean

strongly suggest that these PrP peptides interact with DNA and copper, forming a ternary complex. Thus, we evaluated whether these ligands would modulate aggregation of these PrP peptides. PrP109–149 aggregates on dilution in aqueous solution at low pH [12, 29]; its aggregation at neutral pH is highly reduced. Addition of Cu(II) significantly inhibited the aggregation of PrP109–149 in a concentration-dependent manner at pH 5.0, as observed by static LS (Fig. 3). Other divalent ions, such as zinc, manganese, and magnesium ions, did not inhibit PrP109–149 aggregation significantly (Fig. S6a). Previous data with the rPrP also showed that Cu(II) inhibits amyloid fibril formation, whereas Mn(II) has no significant effect [43]. The inhibitory effect of CuCl2 is due to specific Cu(II) binding, as the addition of the Cu(II) and Cu(I) chelators EDTA and 2,9-dimethyl-4,7diphenyl-1,10-phenanthroline [44] prevents the antiaggregating effect of copper when added simultaneously with CuCl2 in the solution. The addition of CuSO4 leads to the same inhibitory profile as CuCl2 (Fig. S6b). Our LS data show that PrP109–149 aggregation is specifically inhibited by Cu(II) at pH 5.0 (Fig. 3). Although it has been shown that PrP domains lose their affinity for Cu(II) at pH \ 6.0 [4, 10], our characterization of the interaction of PrP109–149 with Cu(II) by EPR spectroscopy (Fig. 2) strongly suggests that this PrP domain binds copper ions at these pH values. We next verified how the Cu(II)–PrP109–149 complex would behave in the presence of nucleic acids. We asked whether both ligands—Cu(II) and DNA—would affect the PrP structure and aggregation, as these molecules are able

123

846

Fig. 4 Modulation of PrP109–49 aggregation at different pH values by Cu(II) and nucleic acids. Aggregation of PrP109–149 was followed by LS at 320 nm after dilution to a final concentration of 3 lM at pH 5.0 (a) or pH 7.4 (b, c). LS values of free peptide, or in the presence of 1 Eq Cu(II), with D44 (a), D67 (b), or R67 (c) were monitored. a all conditions were significantly different from the control (black bar) (P \ 0.05). *P \ 0.05 compared with bar 2 (PrP109–149 ? Cu(II)), #P \ 0.05 compared with the bar 4 (PrP109–149 ? NA). b only PrP109–149 plus previously incubated Cu(II) and D67 was different from the control. c bars 5 (PrP109–149 ? NA ? Cu(II)) and 6 (PrP109–149 ? Cu(II) ? NA) were significantly different from the control (bar 1, PrP109–149). **P \ 0.01, ***P \ 0.001. The 100 % aggregation value relates to the maximum LS value obtained during PrP109–149 aggregation kinetics in the absence of ligands

to interact with PrP in the cellular environment [3, 45–47]. Aggregation of PrP109–149 in the presence of dsDNA sequences D44 and D67 and Cu(II) at a 1:1 ligand-topeptide molar ratio was monitored by LS at pH 5.0 and 7.4 (Fig. 4). At pH 5.0, both Cu(II) and DNA (D44) were able to significantly inhibit PrP109–149 aggregation (Fig. 4, plot a). However, the extent of inhibition was lower when Cu(II) and DNA were present at the same time, regardless of the order in which they were added to the solution (Fig. 4, plot a, asterisk, number sign). This result can be explained by the fact that Cu(II) binds to DNA under these conditions. Our spectroscopic results have demonstrated

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the formation of a Cu(II)–DNA–PrP109–149 ternary complex at low pH, and a small amount of the Cu(II)–DNA complex is also formed. The latter may reduce the availability of Cu(II) and DNA to bind PrP109–149 or it could be a Cu(II)–DNA complex with a lesser effect on peptide aggregation compared with the free forms of the ligands. Alternatively, at the copper-to-phosphate molar ratio used, DNA duplex stability induced by nonspecific Cu(II) binding [48, 49] could modify DNA interactions with PrP109–149, thus leading to a different aggregation profile. At pH 7.4, PrP109–149 aggregation was much less intense in comparison with that at pH 5.0 (Fig. S7). Incubation with either DNA (D67) or Cu(II) did not alter the original LS values (Fig. 4, plot b). The only significant effect seen at pH 7.4 was a small increase in aggregation when PrP109–149 was diluted in a solution containing Cu(II) and D67 (Fig. 4, plot b, three asterisks). There was no significant increase in LS values with control samples containing Cu(II) and D67 only (data not shown). These data suggest that the significant aggregation observed when PrP109–149 was incubated with the Cu(II)–D67 complex is not due to DNA aggregation induced by Cu(II). RNA molecules can also modulate PrP aggregation. Incubation of PrP with RNA molecules led to misfolding and aggregation, generating species toxic to cultured Neuro-2a cells [14, 16]. Here we used a small synthetic RNA molecule, which corresponds to the D67 ribonucleic sequence, R67 [34], to modulate PrP109–149 aggregation in the presence of Cu(II) (Fig. 4, plot c). At neutral pH, R67 alone was not able to modulate PrP109–149 aggregation; however, with sequential addition of Cu(II), or when PrP109–149 was diluted in a solution containing Cu(II) and R67, aggregation was enhanced, as was observed for D67. It seems that complexes formed by nucleic acids (DNA and RNA) with Cu(II) are able to modulate (stimulating at neutral pH, and inhibiting at acidic pH) aggregation of this particular PrP domain. Neurotoxic peptide PrP106–126 aggregates in solution at neutral pH [22]. We thus monitored PrP106–126 aggregation in the presence of Cu(II) and/or DNA for 21 days by turbidity assay at pH 7.4. PrP106–126 aggregation was significantly enhanced only by co-incubation with Cu(II) and D67 from the 14th day onwards (Fig. 5). High turbidity was observed for the D67 and Cu(II) solution on the 14th and 21st incubation days (Fig. 5, plots c, d). This result suggests that a DNA supramolecular structure may be formed under this condition. At low pH we did not observe PrP106–126 aggregation, and neither Cu(II) or DNA was capable of inducing peptide aggregation at pH 5 (data not shown), consistent with the fact that at this pH there is no evidence for the formation of a ternary complex. Overall, our results indicate that the formation of a Cu(II)–DNA–peptide ternary complex at neutral pH induces aggregation of both PrP109–149 and PrP106–126.

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Fig. 5 Aggregation of PrP106–16 modulated by Cu(II) and/or DNA at pH 7.4. Aggregation of PrP106–126 in phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) was monitored by turbidity at 400 nm for 21 days. The Cu(II)–DNA peptide molar ratio of was 1:1:1. a absorbance values on the first day, b absorbance values on the seventh day, c absorbance values on the 14th day, d absorbance values on the 21st day. Statistics: Bonferroni’s multiple comparison test (*P \ 0.05)

Morphology of the aggregated species formed in the presence of Cu(II) and DNA determined by transmission electron microscopy Transmission electron microscopy (TEM) analysis of peptides PrP109–149 and PrP106–126 in their aggregated forms or after incubation with Cu(II), DNA (D67), or both ligands together provided information about the morphology of the resultant species (Fig. 6). PrP109–149 aggregates formed at pH 5.0 are mainly amorphous (Fig. 6a), as previously reported [34]. In the presence of CuCl2, a reduction in the size of these aggregates was observed (Fig. 6b). Either DNA only or DNA and Cu(II) together led to a reduction in aggregation (Fig. 6c, d), which is consistent with the LS data (Fig. 4). Notably, the presence of smaller oligomeric species (indicated by arrows in Fig. 6d) was observed when PrP109–149 was incubated with both copper and DNA. The neurotoxic peptide PrP106–126 displayed a different morphology on interaction with Cu(II), DNA, or RNA after 21 days of incubation at pH 7.4 (Fig. 6e–j). Unbound PrP106–126 presented a fibrillar architecture on the 21st incubation day, as expected [22] (Fig. 6e). After incubation with either DNA (D67) (Fig. 6f) or RNA (R67) (Fig. 6g), the aggregation was reduced, and mainly amorphous aggregates were observed. In the presence of Cu(II) only, PrP106–126 seemed to be fragmented in a heterogeneous population, with aggregates of various sizes, as well as much less structured oligomeric species (Fig. 6h). Dual interaction with Cu(II) and nucleic acids (D67 or R67) seemed to increase peptide aggregation (Fig. 6i, j), as the oligomeric species were found occupying all the microscopy grid. However, one cannot rule out the presence of nucleic acid clusters induced by copper that might

contribute to the increased observed aggregation (Fig. 6i, j). These results show that the effects of Cu(II) and DNA sequences are different for PrP109–149 and PrP106–126, which might be related to the different propensities for aggregation of each peptide, and to different interactions with Cu(II) and nucleic acids. For instance, the interaction of Cu(II) with residues from the C-terminal domain of PrP109–149 at low pH could stabilize this peptide, preventing its aggregation into higher molecular weight species.

Cellular viability evaluation of PrP106–126 complexes with Cu(II) and/or DNA Cell viability assays were performed to provide insight into the toxicity of the Cu(II)–DNA–PrP106–126 complexes (Fig. 7). Only PrP106–126 was investigated for cell viability changes, as PrP109–149 is not cytotoxic when aggregated at pH 5.0 or 7.4 or in the presence of the ligands investigated (not shown). Our TEM analysis evidenced the presence of lower molecular weight species in the presence of DNA or RNA, in comparison with unbound aggregated PrP106–126 (Fig. 6f, g). However, Cu(II) and nucleic acid together increased peptide aggregation (Fig. 6i, j). It is proposed that oligomeric species, rather than mature fibrils, are the main toxic species in protein-aggregating diseases [50, 51]. Therefore, evaluation of the cytotoxicity of these different species is of value. We treated murine neuroblastoma cells (Neuro-2a) with free PrP106–126, Cu(II)–PrP106–126, DNA– PrP106–126, and the three molecules combined (forming a ternary complex at pH 7.5), and 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction was evaluated as described previously [34]. For PrP106–126 we observed that after 14 or 21 days of the aggregation

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Fig. 6 Transmission electron microscopy analysis evidences different morphologies of the aggregated PrP peptides formed in the presence of Cu(II) and DNA. The PrP109–149 concentration was 10 lM (a–d) and the PrP106–126 concentration was 25 lM (e–j). Samples were prepared in MES buffer, pH 5.0 (a–d, k, l) or in PBS,

pH 7.4 (e–j). Peptides were incubated with either Cu(II) and/or nucleic acid (D67 or R67) at equimolar concentrations. In all cases, Cu(II) was provided as CuCl2. Scale bars a 0.25 lm, b, d, f, h, i, k 1.0 lm, c, l 2.0 lm, e, g, j 0.5 lm

protocol, the aggregated species formed reduced the viability of Neuro-2a cells in culture (Fig. 7c, d). Incubation of the peptide with either D67 or R67 did not increase its cytotoxicity. However, when Cu(II) was added (in the presence or absence of nucleic acids), there was a significant reduction of cell viability for fresh aggregates and those incubated for up to 21 days (Fig. 7). Free Cu(II) and nucleic acids were not toxic to Neuro-2a cells at the concentrations investigated (not shown). These data indicate that interaction of PrP106–126 with Cu(II) causes cellular dysfunction, and that further binding to nucleic acids does not alter the cytotoxic properties of the Cu(II)–PrP106–126 complexes.

acid molecules have been shown to induce rPrP conformational changes [4, 11, 12, 19, 54]. Moreover, Cu(II) can induce PrPC cellular internalization [55], indicating that copper-loaded PrP is present in different cellular environments, with different proton concentrations. It was reported that copper binding through the N-terminal region of PrP, but outside the octarepeat domain, led to an interaction of the C-terminal region with the copper-bound N-terminus of this protein [54]. This result suggests possible allosteric events mediated by copper, implying that certain PrP domains are not available for interaction with other ligands on Cu(II) binding. This scenario would lead to modulation of PrP physiological functions and/or could be related to the pathogenesis of TSEs. We initially investigated if PrP106–126 and PrP109–149 would coordinate Cu(II) at neutral and acidic pH. At pH 7.5, Cu(II) binding to PrP109–149 and PrP106–126 leads to complexes where His-111 is the main copper-anchoring residue, as described before [10], and His-140 does not take part in the coordination (Fig. 8). We found that Cu(II) binding at this site has no significant effect in peptide aggregation at neutral pH for both peptides (Figs. 4, 5). Previous studies reported that Cu(II) induces fibril formation by human PrP106–126 [22] at neutral pH. It is plausible

Discussion In this work we evaluated the combined effect of copper ions and nucleic acids in the aggregation and conformation of PrP peptides comprising residues 106–126 and 109–149 (PrP106–126 and PrP109–149) at different pH values. Structural changes in PrP, mainly in the N-terminal domain and the beginning of helix 1 [52, 53], are fundamental steps in prion disease pathogenesis, and both Cu(II) and nucleic

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Fig. 7 Cu(II) binding increases the cytotoxicity of PrP106–126. PrP106–126 at 25 lM was incubated with Cu(II), DNA, RNA, or both Cu(II) and nucleic acids in PBS, pH 7.4 at equimolar ratios. Fresh samples (a) or samples preincubated for 7 days (b), 14 days (c), and 21 days (d) were added at a final concentration of 5 lM to each well containing a monolayer of Neuro-2a cells. 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction was evaluated

as described in ‘‘Materials and methods.’’ The data are expressed as the percentage of MTT reduction in relation to the control (cell medium). Error bars represent standard deviations of at least three independent measurements, each one in triplicate. Statistics in relation to the control bar: *P \ 0.05, **P \ 0.01, ***P \ 0.001, ****P \ 0.0001. Statistic in relation to free PrP106–126: #P \ 0.05

Fig. 8 The main effects caused by Cu(II) and DNA binding to the PrP peptides. Left binding of Cu(II) to PrP109–149 or PrP106–126 at pH 7.5. Addition of nucleic acid (NA) leads to the formation of ternary complexes [Cu(II)–NA–peptide]. Only oligomeric complexes formed

with PrP106-126 are cytotoxic. Right binding of Cu(II) to PrP109–149 or PrP106–126 at pH 5.5. Addition of NA leads to the formation of a ternary complex only for PrP109–149 at pH 5.5, and it is not cytotoxic

that we observed no significant effect of Cu(II) by turbidity assays at pH 7.4 because of the low sensitivity of the technique; however, morphological analysis evidenced the

presence of a heterogeneous PrP106–126 aggregate population in the presence of Cu(II) (Fig. 6h), and which might contain fibrillar species.

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In contrast, an inhibitory effect of Cu(II) was observed in the aggregation of PrP109–149 at pH 5.0. Cu(II) binding to PrP109–149 at low pH leads to the formation of a distinct oxygen-rich Cu(II)–PrP109–149 complex that involves carboxylic acids from the C-terminal region (potentially Asp144 and Asp-147 or Glu-146) and/or water molecules (Fig. 8). The formation of this complex requires residues at the C-terminal region, and thus it is not formed in PrP106–126. This species is responsible for the significant inhibitory effect of Cu(II) in the aggregation of PrP109–149. It is plausible to propose that Cu(II) binding at the C-terminal region of PrP109–149 could cause conformational changes that may interfere with the intermolecular hydrophobic interactions involved in its aggregation pathway. As mentioned above, Cu(II) can induce PrPC cellular internalization by endocytosis [55], indicating that copper-loaded PrP is present in endosomes where proton concentrations are high. Thus, the low-pH Cu(II)– PrP109–149 complex identified in this study could be a relevant species that is formed at the endosomal level and it could play an important inhibitory role in PrP aggregation. Voltammetric measurements strongly suggested that PrP remains copper-bound in diverse cellular environments [56]; also, rPrP exposes different binding sites for heparin, depending on the solution pH [57]. These results indicate that rPrP might suffer conformational changes depending on its cellular location, thus interacting differently with copper, nucleic acids, and/or other identified ligands. In this study, strong evidence for the formation of Cu(II)– DNA–PrP109–149 (at neutral and acidic pH) and Cu(II)– DNA–PrP106–126 (at neutral pH) ternary complexes has been provided by EPR and Raman spectroscopy. Although further spectroscopic investigation is needed to identify the nature of the coordinating ligands in these complexes, our results suggest that they may favor the formation of oligomeric and cytotoxic structures (Fig. 8). Both Cu(II) binding and DNA binding by PrP109–149 reduced its aggregation to ordered oligomers, as seen by LS and TEM at pH 5.0. The presence of both Cu(II) and DNA did not inhibit aggregation to the same extent as the ligands alone, probably owing to an interaction of Cu(II) with DNA. The morphologies of the PrP109–149 species generated on incubation with Cu(II), DNA, or Cu(II) and DNA were different. Specifically, smaller oligomeric species were formed when both Cu(II) and DNA were added to the peptide solution. The formation of toxic oligomers is a hallmark of neurodegenerative processes [50, 58]. Interaction of recombinant full-length PrP with DNA (D67 and D44 sequences) and RNA led to cytotoxic species. A previous report showed that recombinant PrP90–231 oligomerizes into

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species that are toxic to SK-N-SH cells on addition of Cu(II) at pH 5.0 [59], excluding the role of the octarepeat domain in this process. Herein, we found that mainly Cu(II) binding by PrP106–126, in the region encompassing His-111 is associated with the formation of cytotoxic oligomeric species. Indeed, cell viability assays showed that addition of the RNA sequence (R67) and Cu(II) to PrP106–126 induces higher cytotoxicity (on the 21st incubation day, only), which might result from the different morphology of the PrP106–126 aggregates formed in the presence of both ligands. The cell-death mechanism remains to be investigated, although preliminary results with recombinant full-length murine PrP indicate that DNA–rPrP complexes induce cellular apoptosis [34]. In conclusion, this study provides strong evidence for the formation of Cu(II)–nucleic acid–PrP peptide ternary complexes, which lead to the formation of oligomeric species with different morphologies and cytotoxicity profiles that might be relevant for the pathogenesis of TSEs (Fig. 8). The nucleic acids used in this study have previously been shown to interact with either recombinant fulllength PrP or PrP109–149 [12, 32, 34]. Liu et al. [60] performed a pioneer study where it was revealed by CD measurements that the conformation of full-length ovine PrP is affected by both RNA and Cu(II). Although our work has the limitation of analyzing only isolated PrP domains, it is the first report that characterizes the biophysics, morphology, and cytotoxicity of this dual interaction. Moreover, one could infer that such interactions may also occur in full-length PrP, as suggested by the results obtained for ovine PrP [60]. Conformational changes induced by both nucleic acid and copper would lead to aggregated species that could be deleterious to the cell. Our study also underscores the importance of obtaining structural information about PrP–ligand complexes to help elucidate PrP function and conversion to PrPSc [61], which in turn can aid the development of new therapeutic strategies for TSEs. Acknowledgments The authors thank Icaro A. Marques for help with protein purification, Trinidad Arcos-Lopez and Jose Luis Esquivel for help with PrP109–112 synthesis and initial characterization, and Luis Mauricio T. R. Lima and Lina Rivillas-Acevedo for helpful discussions. We are very grateful to the Laborato´rio de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer (Instituto de Biofı´sica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro) and the Laborato´rio de Biologia Estrutural (Instituto Nacional de Metrologia, Rio de Janeiro) for use of the TEM facility. This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı´fico e Tecnolo´gico, Instituto Nacional de Cieˆncia e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem, Fundac¸a˜o de Amparo a` Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, Coordenac¸a˜o de Aperfeic¸oamento de Pessoal de Nı´vel Superior, and Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologı´a (grant 128255 to L.Q. and fellowship to C. S.-L.).

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